《Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes》：Mechanisms of blood-brain barrier penetration: A molecular dynamics study on R9 and MPG peptide translocation
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本研究利用分子动力学与增强采样技术，在精确模拟人脑微血管内皮细胞膜模型的基础上，首次系统地探究了细胞穿膜肽（CPP）R9与MPG跨血脑屏障（BBB）转运的分子机制。文章揭示了两种多肽（CPP）均面临巨大的自由能垒，明确了N端与精氨酸残基在起始膜相互作用中的核心作用，并深入阐释了膜弯曲、多肽去折叠及多不饱和脂质链在降低转运能垒中的协同效应，为理性设计靶向中枢神经系统（CNS）的递送载体提供了关键的理论依据与设计指引。
1. 引言
治疗中枢神经系统（CNS）疾病的主要挑战之一，是如何让药物有效穿透血脑屏障（BBB）。这道由内皮细胞（EC）、基底膜、周细胞和星形胶质细胞共同构成的精密防线，严格调控着血液与脑组织之间的物质交换。其内皮细胞通过紧密连接相连，形成疏水层，使得分子量大于400 Da或亲水性强的药物分子中，约98%都被阻挡在外。细胞穿膜肽（CPPs）是一类能够高效穿越生物膜同时保持膜完整性的短肽序列，作为潜在的药物递送载体备受关注。然而，其确切的跨膜转运机制尚未完全阐明，部分原因是过往研究多使用简化的膜模型，无法反映BBB复杂的真实脂质组成。本研究旨在通过结合粗粒化（CG）分子动力学（MD）与增强采样技术，在一个人脑微血管内皮细胞的真实膜模型上，深入探究R9和MPG这两种特性迥异的CPPs的转运机制。
2. 计算方法
研究采用了经实验验证的九组分对称BBB膜粗粒化模型，该模型精确模拟了人脑微血管内皮细胞的生理脂质组成，富含多不饱和酰基链脂质和高胆固醇。肽段结构经过全原子模拟优化后，转换为MARTINI2力场的粗粒化模型。为了克服CPP自发转运在常规MD模拟中极低的发生概率，研究运用了伞形采样（US）和良好回火元动力学（WTM）等增强采样技术。
具体而言，通过US模拟，以肽段与膜局部质心沿膜法线方向（z轴）的距离作为集体变量（CV），估算了跨膜转运的自由能分布。此外，还分别以肽段的回旋半径（Rg）和膜的整体曲率（Γ）作为CV进行WTM模拟，以探究CPP的折叠/去折叠行为及其对膜弯曲热力学的影响。所有模拟均使用GROMACS软件结合PLUMED插件完成。
3. 结果与讨论
3.1. MPG和R9穿过BBB的转运自由能
通过伞形采样获得的自由能曲线显示，尽管经过了微秒尺度的采样，R9和MPG在穿过BBB的疏水核心时，仍面临高达约250 kcal mol?1的显著自由能垒。与使用单一组分模型膜的研究相比，如此高的能垒与BBB膜的复杂性（多组分、高胆固醇含量）导致渗透性降低的已知特性相符。这表明，在完整双层膜中，单个CPP的自发转运在能量上是极为不利的，暗示体内更可能通过多肽协同作用（如形成孔道）、与两亲性分子复合或能量依赖的内吞等辅助机制来实现跨膜。
尽管能垒绝对值很高，但R9的能垒比MPG仍高出约10 kcal mol?1。分析关键中间态（A：吸附在膜表面；B：插入疏水核心；C：到达对侧叶）发现，能垒最高点对应状态B。在状态B，R9的插入会拖拽脂质头基内陷，造成膜缺陷，导致水分子渗透进入疏水核心，并扰动胆固醇的分布。而MPG的穿过对水密度影响较小，对胆固醇分布的扰动也较弱，表明其穿越过程对膜的破坏性更小。
氢键分析显示，R9在转运过程中主要与高度不饱和的脂质（如SAPE、SAPI、SAPS）发生持久的相互作用。这些脂质会跟随CPP发生叶层翻转（flip-flop），如同一个移动的“非极性笼子”，包裹肽段并协助其滑过疏水核心，从而降低转运能垒。MPG也显示出与精氨酸（ARG25）相关的关键相互作用，但其引发的脂质叶层翻转事件少于R9。
膜曲率分析表明，R9能诱导并稳定膜的高曲率构象，其存在使膜的弯曲自由能最低点从平坦状态转移到弯曲状态（Γ ≈ 0.6），这有助于其转运。而MPG对膜曲率的影响则弱得多，平坦膜仍是其最稳定的结构。
3.2. 作为膜曲率函数的自由能
进一步的膜弯曲自由能模拟证实，R9能够显著促进并稳定BBB膜的弯曲构型，降低了膜在弯曲时的刚性，这从熵的角度有利于转运。这种膜弯曲和脂质头基的重排，与形成“环形孔”（toroidal pore）的模型相容。相反，MPG的存在对膜弯曲自由能曲线的影响很小，它并不主动促进弯曲，这可能是由于其两亲性结构在穿越时已横跨整个膜，产生了不同的空间和静电约束。
3.3. CPP二级结构的影响
通过以回旋半径为集体变量进行模拟，研究了肽段折叠状态对转运的影响。对于R9，在水溶液中其为非结构态，而在膜附近或吸附在膜上时，其折叠构象（较小Rg）得到稳定，构象自由度增加，这从能量上有利于转运。氢键分析表明，初始接触（状态A0）时，R9主要通过N端与膜作用；而在吸附状态（A），所有精氨酸侧链均与脂质头基形成持久氢键，将肽段锚定在膜表面。
对于MPG，在各种环境中紧凑构象均占优势。在水里，疏水残基的暴露使伸展构象能垒很高；在膜附近时，伸展构象的能垒降低，肽段发生部分去折叠和重取向，C端（含LYS24和ARG25）或N端可能参与膜相互作用。当完全吸附在膜上时，静电和空间位阻效应强烈倾向于折叠构象。MPG的转运能垒主要来自穿过疏水核心的焓罚，而非熵罚。二级结构分析显示，在本研究采用的BBB膜组成下，MPG与R9类似，也主要呈现无规则卷曲。
4. 结论
本研究揭示，在复杂的BBB膜模型中，尽管R9和MPG的化学类别（阳离子型 vs. 初级两亲性）和引发的膜扰动模式不同，但两者均面临极高的跨膜自由能垒，这表明膜的组成本身构成了主要的转运阻力。研究明确了N端和精氨酸残基在起始膜相互作用中的关键作用。一个重要的发现是，两种CPP都有选择性地招募高度不饱和脂质（SA脂质），这些脂质通过诱导的叶层翻转事件协助肽段转运，并参与缓解肽段引起的膜机械应力。此外，膜环境能够稳定CPP在水溶液中不利的构象（稳定R9的折叠构象和MPG的去折叠构象），从而降低了转运的熵罚。这些关于CPP-BBB相互作用的分子机制细节，为未来理性设计能够高效穿越血脑屏障的肽类递送载体提供了宝贵的见解和指导。
