PLA2类似毒素与sPLA2抑制剂AZD2716复合物的结构与药理学分析：与Varespladib的比较

《Biochimie》：Structural and Pharmacological Analysis of a PLA 2-like Toxin in Complex with the sPLA 2 Inhibitor AZD2716: Comparisons to Varespladib

蛇毒PLA2-like毒素抑制机制研究显示varespladib和AZD2716通过阻断疏水通道（HCh）抑制脂肪酸结合，结构比较揭示其作用位点相似但抑制机制存在差异，为药物重定位提供新思路。

　　

吉列尔梅·H·M·萨尔瓦多（Guilherme H.M. Salvador）|埃莉萨·S·佩雷拉（Elisa S. Pereira）|瓦尔特·L·G·卡瓦尔坎特（Walter L.G. Cavalcante）|保拉·拉德伊拉·奥尔托拉尼（Paula Ladeira Ortolani）|康苏埃洛·拉托雷·福尔特斯-迪亚斯（Consuelo Latorre Fortes-Dias）|布鲁诺·洛蒙特（Bruno Lomonte）|马修·R·卢因（Matthew R. Lewin）|马科斯·R·M·丰特斯（Marcos R.M. Fontes）

巴西圣保罗州立大学（UNESP）生物科学研究所生物物理学与药理学系，博图卡图（Botucatu-SP）

摘要

磷脂酶A₂（PLA₂）和类似PLA₂的毒素是Bothrops蛇毒引起局部肌肉坏死效应的关键因素，也是重要的抑制靶点。合成分子如varespladib（LY315920）和AZD2716最初是作为人类IIA组PLA₂的抑制剂开发的，其中varespladib显示出重新用于对抗蛇毒毒素的潜力。本文通过体外神经肌肉阻断实验、微尺度热泳技术、晶体学和生物信息学分析，研究了蛇毒Lys49-PLA₂类毒素以及另一种强效的sPLA₂抑制剂AZD2716的作用机制。与varespladib类似，AZD2716在微摩尔浓度下与毒素的疏水通道（HCh）结合——该通道已被报道为其他抑制剂和脂肪酸的结合位点——并采用与其他Lys49-PLA₂类毒素复合物相似的二聚体构象。结构比较表明，这些配体阻断了脂肪酸进入HCh的途径，从而阻止了毒素的激活。先前提出的PLA₂类毒素的作用机制涉及脂肪酸与HCh的结合，导致构象变化并暴露毒素的功能位点（主要位于C末端）。因此，物理上阻止脂肪酸进入HCh可以抑制其毒性作用。尽管AZD2716和varespladib结合于类似PLA₂类毒素和催化型sPLA₂的相似区域，但由于功能位点的差异，它们通过不同的机制发挥抑制作用。这些发现强调了药物再利用作为开发互补疗法以减轻蛇咬伤严重局部损伤的潜力，同时也适用于药物发现和重新定位策略。

引言

Bothrops属的蛇类是中南美洲大多数蛇咬伤事件的原因。这一现象与该属物种在该大陆的广泛分布、对农业改变环境的强适应能力以及农村地区与人类的接触有关[1]。

Bothrops蛇类引起的中毒通常会导致严重的局部组织损伤，包括肌肉坏死、出血、水疱形成和皮肤坏死，可能导致永久性后遗症，如畸形和截肢。因此，除了致命性外，发病率还给医疗资源匮乏的社区带来了重大的健康和社会负担[2]。

肌肉坏死是一个显著的局部效应，主要由碱性磷脂酶A₂（PLA₂）酶和非酶性质的PLA₂类毒素单独或协同作用引起[3]、[4]、[5]。来自Bothrops蛇毒的PLA₂类肌毒素是已知蛋白质，它们通过非催化性的膜损伤机制直接作用于骨骼肌细胞[6]、[7]、[8]、[9]。这些毒素主要以同源二聚体形式存在（如晶体结构和溶液研究所示），并在C末端具有两个功能位点。这些位点通过由赖氨酸和精氨酸形成的正电荷簇（膜对接位点 - MDoS）与目标膜相互作用，并通过疏水残基亮氨酸和苯丙氨酸（膜破坏位点 - MDiS）造成破坏[6]、[7]、[8]、[9]。

目前最有效的蛇咬伤治疗方法是使用抗蛇毒血清，这些血清由接种了一种或多种蛇毒的马产生的抗体制备而成[10]。由于患者需要从偏远地区前往医院，治疗延迟，且不同蛇毒成分的抗原多样性及其免疫原性各异，这些抗蛇毒血清的有效性可能存在很大差异[11]、[12]。此外，抗体的药代动力学特性可能与某些毒素（尤其是那些引起局部组织损伤的毒素，如出血性金属蛋白酶和肌肉毒性PLA₂）的快速作用不匹配[13]、[14]。因此，尽管抗蛇毒血清已被证明能有效中和循环毒素的主要系统性和危及生命的作用，但在医院使用之前，不可逆的局部组织损伤可能已经发生[3]、[4]。在过去十年中，人们一直在理论和实践中探索基于小分子抑制剂的现场解毒剂的潜力，特别是那些开发成本较低的重新定位分子[15]、[16]。

有效治疗局部效应仍然是应对Bothrops及其他类型蛇咬伤的重要挑战。这促使人们探索来自天然和合成来源的化合物，以补充和/或增强传统抗蛇毒血清疗法[17]。其中一些合成分子，如varespladib（LY315920）和marimastat单独或联合使用，显示出满足这一需求的潜力[16]、[18]。varespladib最初是为抑制与严重败血症、类风湿性关节炎、溃疡性结肠炎及急性冠状动脉和胸综合征相关的分泌型磷脂酶A₂（sPLA₂）介导的炎症而开发的[19]。然而，在II/III期临床试验中未能证明其足够的有效性；尽管几种用于实体瘤的金属蛋白酶抑制剂也未能成功，但它们在蛇咬伤治疗中显示出潜力[20]、[21]、[22]、[23]、[24]。尽管如此，由于人类IIA组sPLA₂与蝰蛇毒中的PLA₂/PLA₂类毒素具有高度结构同源性，varespladib已被评估用于多种具有高PLA₂含量的重要蛇种，包括Bothrops属[12]、[16]、[25]、[26]。值得注意的是，varespladib在体外实验中以纳摩尔和皮摩尔浓度有效抑制了这些蛇毒的毒性作用，并在多项临床前研究中显示出生存优势[16]、[27]、[28]。还有证据表明，添加varespladib可以加速患者恢复，这一点在最近完成的II期临床试验中得到了验证[29]。

合成分子AZD2716最近被描述为一种具有长期治疗冠状动脉疾病潜力的新型化合物。它作为强效的分泌型磷脂酶A₂（sPLA₂）抑制剂设计，旨在减少药物相互作用的风险，因此被选中进行临床试验，但在VISTA-16项目后被阿斯利康（AstraZeneca）放弃[30]。基于与varespladib相似的作用机制，并使用类似的初始片段，AZD2716也可能作为蛇毒中PLA₂酶或PLA₂类毒素的抑制剂。最近的体外实验支持了这一假设，但早期的体内研究结果与varespladib相比较为复杂[31]。这引发了关于解释这些差异机制的重要问题。

为了阐明AZD2716对PLA₂类毒素（PrTX-I和BthTX-I）的抑制机制，并将其与之前的varespladib研究进行比较[32]，我们采用了结合功能测试、生物物理分析和晶体学研究的综合方法。毒性测试表明AZD2716能有效中和毒素引起的肌肉毒性效应。通过微尺度热泳技术表征了AZD2716与毒素之间的相互作用，揭示了直接的特异性结合模式。此外，毒素/AZD2716复合物的晶体结构揭示了毒素功能位点（MDoS/MDiS区域）的关键分子相互作用。与其他PLA₂类毒素-抑制剂复合物的结构比较为合理设计和重新利用针对蛇毒PLA₂毒素的抑制剂提供了见解，并有助于决策是否继续或停止其针对不同适应症的研发。

节选内容

Lys49-PLA₂类毒素的分离及AZD2716的来源

通过两步液相色谱法从Bothrops pirajai和B. jararacussu的粗毒液中分离出了两种Lys49-PLA₂类毒素，分别命名为PrTX-I和BthTX-I。首先，根据[33]的方法，使用CM-Sepharose柱（2 x 20 cm）进行离子交换分离，然后使用C₁₈柱（Shimadzu）进行反相HPLC纯化[32]。通过卵黄法评估了BthTX-I的PLA₂催化活性

AZD2716抑制BthTX-I毒素的毒性作用

varespladib（LY315920）作为一种广谱蛇毒和毒素抑制剂显示出巨大潜力，已被证明能抑制六大洲85多种不同蛇毒中的PLA₂，这突显了其药物再利用的潜力（例如[16]、[53]、[54]、[55]、[56]、[57]、[58]）。此外，varespladib还被证明能部分中和体外条件下由BthTX-I引起的神经肌肉阻断作用，BthTX-I是一种从B. jararacussu分离出的PLA₂类肌毒素[32]。

在开发sPLA₂抑制剂的过程中

结论

Bothrops蛇毒引起的显著且迅速的效应仍然是治疗中毒患者的主要挑战。PLA₂和PLA₂类毒素的快速作用机制可导致严重的局部组织坏死，立即抑制这些蛋白质对于防止组织损失甚至肢体截肢至关重要。此前已测试了多种天然和合成化合物，它们表现出令人满意的抑制效果和口服生物利用度

CRediT作者贡献声明

吉列尔梅·H·M·萨尔瓦多（Guilherme H. M. Salvador）：撰写初稿、验证、研究、数据分析。马修·R·卢因（Matthew R. Lewin）：撰写、审稿与编辑、概念化。布鲁诺·洛蒙特（Bruno Lomonte）：撰写、审稿与编辑、概念化。瓦尔特·L·G·卡瓦尔坎特（Walter L. G. Cavalcante）：监督、研究、数据分析。埃莉萨·S·佩雷拉（Elisa S. Pereira）：研究。康苏埃洛·拉托雷·福尔特斯-迪亚斯（Consuelo Latorre Fortes-Dias）：数据分析、监督。保拉·拉德伊拉·奥尔托拉尼（Paula Ladeira Ortolani）：数据分析、研究。马科斯·罗伯托·德·马托斯·丰特斯（Marcos Roberto de Mattos Fontes）：撰写——

未引用的参考文献

[51]。

利益冲突

M.R.L在Ophirex Inc.（一家公益公司）拥有股权。其他作者声明不存在利益冲突。

伦理声明

涉及动物的实验程序获得了米纳斯吉拉斯联邦大学（CEUA UFMG 25/2021）动物实验伦理委员会的批准。

利益冲突声明

X作者声明以下可能被视为潜在利益冲突的财务利益/个人关系：M.R.L在Ophirex Inc.（一家公益公司）拥有股权。其他作者声明不存在利益冲突。

致谢

本工作得到了圣保罗州研究基金会（FAPESP，项目编号2020/10143-7和2019/05958-4）、国家科学技术发展委员会（CNPq，项目编号302643/2021-4和150448/2022-8）、高等教育人员培训协调委员会（CAPES）以及哥斯达黎加大学研究部的财政支持。我们感谢巴西国家同步辐射实验室（LNLS）和Ophirex Inc.提供的帮助