《Biomedicine & Pharmacotherapy》：Advancing adoptive cellular immunotherapy via Notch-based
ex vivo T cell development platforms
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这篇综述系统阐述了如何利用Notch信号平台在体外（ex vivo）从造血干/祖细胞（HSPC）或iPSC诱导生成T细胞及其前体，为开发“现货”（off-the-shelf）通用型CAR-T等过继性细胞免疫疗法提供了新策略。文章详述了从基质细胞依赖的OP9-DLL1/4共培养体系，到无基质的固定化配体、微珠乃至可溶性Notch激动剂等平台的发展历程，并探讨了其向临床转化的潜力和挑战。
1. 引言
T细胞免疫疗法已成为癌症治疗中最有前景的领域之一，它兼具精准的分子靶向性和“活的”药物所带来的持久疗效。然而，传统的自体T细胞疗法存在成本高、制备时间长、患者自身T细胞质量不佳等局限。开发“现货”（off-the-shelf）的通用型同种异体T细胞产品，是解决这些瓶颈的关键方向。本文旨在阐述，通过Notch信号平台在体外（ex vivo）诱导产生T细胞，为实现这一目标开辟了新的技术路径。
2. Notch信号通路及其在胸腺T细胞发育中的作用
Notch信号是一条进化上保守的通路，在哺乳动物T细胞发育中起核心作用。Notch配体主要分为Delta样（DLL1, DLL3, DLL4）和Jagged（Jagged1, Jagged2）两个家族，其中DLL1和DLL4是比Jagged更有效的Notch激动剂，在驱动造血干/祖细胞（HSPC）向T细胞谱系定向分化、同时抑制B细胞潜能的过程中扮演关键角色。在体内，胸腺上皮细胞（TEC）表达的DLL4为T细胞前体提供了关键的微环境信号，使其从早期T细胞祖细胞（ETP）逐步发育为CD4+CD8+双阳性（DP）胸腺细胞，并最终经历严格的选择（阳性选择和阴性选择）后，分化为成熟、功能完整且对自身抗原耐受的CD4+或CD8+单阳性T细胞。这一复杂的空间组织和信号网络，是体外模拟T细胞发育的蓝本。
3. 基于Notch信号的体外T细胞培养体系
体外重现T细胞发育的探索经历了从复杂的胎儿胸腺器官培养，到更简化的二维培养体系的演进。目前，Notch信号平台已能够从骨髓、外周血、脐带血或多能干细胞来源的HSPC中，体外诱导生成T系细胞。
早期的里程碑是2002年建立的OP9-DLL1共培养模型。OP9是一种缺乏巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）的小鼠骨髓基质细胞系，通过外源表达高密度的DLL1或DLL4，可高效支持T细胞发育。OP9-DLL1/4系统虽然稳定、可重复，但依赖胎牛血清、存在鼠源基质细胞带来的生物安全风险，且难以规模化放大。
为了克服这些局限，无基质细胞的Notch平台应运而生，主要分为三类：
- 1.
固定化配体系统：将重组DLL1或DLL4蛋白直接包被在培养板表面。配体密度是关键参数：低密度（0.125–2.5 μg/ml）促进HSPC扩增但偏向B/髓系，而高密度（5–10 μg/ml）则驱动T细胞定向。为进一步模拟体内胸腺微环境的生物力学特征，有研究将Notch配体（如DLL4）与血管细胞粘附分子1（VCAM-1）联用。VCAM-1通过其配体整合素α4β1促进细胞粘附与迁移，从而增强Notch信号转导，能将诱导多能干细胞（iPSC）来源的T细胞祖细胞产量提高多达80倍。
- 2.
微珠包被系统：将DLL4等配体固定在微珠上。这种系统与固定化配体系统原理类似，但更具灵活性和临床转化潜力。特别有前景的应用是结合iPSC技术生产“现货”CAR-T细胞：从GMP级的iPSC库获取细胞，将CAR基因整合到T细胞受体α恒定区（TRAC）位点以实现生理性调控，再通过DLL4/VCAM-1微珠诱导其分化为CAR-T细胞。
- 3.
可溶性Notch激动剂：这是一种最新进展，通过设计具有特殊几何结构、价态和刚性的多价可溶性激动剂（如C3-DLL4），能够在溶液中直接对Notch受体施加足够的机械力以激活信号通路。这种真正的悬浮培养系统，为在大规模生物反应器中进行GMP级生产提供了极大便利。
值得注意的是，这些体外系统通常更易产生CD8+T细胞，而生成CD4+T细胞则较为困难。有研究表明，在CD4+CD8+双阳性阶段，通过时间调控地撤除Notch信号，可以指导细胞向CD4+谱系分化。
4. 使用体外生成的T细胞前体进行过继性细胞治疗
基于Notch平台生成的T细胞前体（而非成熟T细胞）在过继性细胞治疗中展现出独特优势。早在2006年，研究就表明，将同种异体T细胞前体（由OP9-DLL1系统生成）与去T细胞的造血干细胞共移植，能显著增强免疫重建。其核心优势在于安全性：这些前体细胞在输入受体时尚未进行T细胞受体（TCR）重排，它们会归巢到受体胸腺，经历完整的胸腺阳性与阴性选择过程，从而获得对宿主抗原的耐受性，因此即使使用完全HLA不匹配的供体细胞，也不会引发移植物抗宿主病（GVHD）。这为实现通用型“现货”治疗奠定了基础。
该平台同样易于进行基因工程改造。在培养T细胞前体时即可引入嵌合抗原受体（CAR），从而生成具有肿瘤特异性、且能在体内维持长期耐受和功能的T细胞。当然，该策略也存在一定局限性，包括疗效出现延迟（需等待胸腺内发育成熟）、以及需要受体具备有功能的胸腺组织。不过，研究也观察到前体细胞可在肠系膜淋巴结等胸腺外部位成熟，提示其应用可能比预想的更广泛。
5. Notch平台细胞疗法的转化与临床潜力
基于Notch的系统可用于生产未成熟的T祖细胞（pro T）或成熟的T细胞，两者各有适用场景。成熟T细胞输注后能立即发挥效应功能，适用于需要快速控制肿瘤的临床情况，但面临GVHD风险，通常需要使用自体或HLA匹配的供体细胞。而T细胞前体疗法的最大优势在于其安全性，允许使用无需严格HLA匹配或复杂基因编辑的同种异体“现货”产品，但其疗效的发挥有数周的延迟。因此，选择成熟或未成熟T细胞需根据具体的临床背景权衡。
随着从依赖基质细胞的体系向无基质、完全人源化的Notch平台发展，大规模生产T系细胞的成本和复杂性已显著降低。虽然目前仅有一项临床应用报道是使用固定化DLL1来扩增脐带血HSPC用于移植，并未生产T细胞前体，但可以预见，首批使用Notch平台生产细胞进行癌症过继免疫治疗的临床试验已迫在眉睫。这些进展共同指向一个未来：更高效、更安全、可规模化的“现货”T细胞免疫疗法将成为现实。
