基于二苯基-1,2,4-噁二唑骨架的新型HDAC6抑制剂的发现，这些抑制剂在缓解炎症和化疗引起的机械性超敏反应方面具有潜在疗效

《Bioorganic Chemistry》：Discovery of novel HDAC6 inhibitors based on the diphenyl-1,2,4-oxadiazole scaffold with potential efficacy in alleviating inflammation- and chemotherapy- associated mechanical hypersensitivity

高效催化人参皂苷转化为稀有皂苷的β-葡萄糖苷酶Lrbgl研究

　　

周晓雪|李哲哲|熊磊|周玉娟|程颖|曹璐|胡海明|高铁祥|刘洪涛

湖北中医药大学基础医学院，中国武汉430065

摘要

由于稀有人参皂苷（尤其是化合物K（CK）具有显著的生物活性和在制药及功能性食品中的潜在应用价值，因此受到了广泛关注。本文从Lacticaseibacillus rhamnosus中鉴定出一种新型β-葡萄糖苷酶（Lrbgl）。Lrbgl在弱酸性pH（5.0–7.0）条件下表现出最佳活性，并且在高达40°C的温度下仍能保持稳定。该酶在异丙醇和乙醇等有机溶剂存在下也保持稳定，且加入0.2–1 M NaCl后其催化活性显著增强。位点定向突变实验确认天冬氨酸232（Asp232）和谷氨酸417（Glu417）是β-糖苷键水解的关键催化残基；分子对接分析显示Glu719、Arg515、Ser166和Arg164与人参皂苷底物的C-3/C-20糖基团之间存在关键的氢键相互作用，有助于底物在活性位点的稳定。功能表征表明Lrbgl属于I型人参皂苷水解酶，能够特异性地切割原人参二醇型人参皂苷中C-3和C-20位置的β-(1→2)和β-(1→6)糖苷键。通过Rb1→Rd→F2→CK的途径，Lrbgl可将人参皂苷Rb1几乎完全转化（转化率超过99.9%），生成CK的摩尔效率为60%——这使其区别于通常只能将Rb1水解为Rd的益生菌来源的β-葡萄糖苷酶。当应用于三七皂苷时，Lrbgl能够将1.75 g/L的原人参二醇型人参皂苷转化为1.15 g/L的稀有人参皂苷（主要为CK和F2），其中CK的摩尔产率为76%。这项工作为高价值人参皂苷的生产提供了一个高效的酶学平台，展现了其在食品和制药生物有机催化领域的应用潜力。

引言

五加科植物包含约14种Panax属物种，其中Panax ginseng、Panax quinquefolius和Panax notoginseng在产量方面是主要栽培品种[1]。这些物种的核心生物活性成分均为人参皂苷[2]、[3]、[4]。根据皂苷元的结构，人参皂苷可分为达玛烷型（dammarane-type）和齐墩果酸型（oleanolic acid-type）。达玛烷型人参皂苷进一步分为原人参二醇型（PPD-type，包括Rb1、Rb2和Rd）和原人参三醇型（PPT-type，包括Rg1）[5]。

然而，这些主要人参皂苷的高糖基化导致其在肠道中的吸收率低，口服生物利用度较差[6]、[7]、[8]。在胃酸和肠道微生物群的作用下，它们可以转化为称为稀有人参皂苷的次级代谢产物。与糖基化形式相比，去糖基化的稀有人参皂苷分子量更小，膜通透性更高，从而提高了生物利用度和药理活性[9]。例如，野生人参中含有超过80%的主要人参皂苷（如Rb1、Rb2、Rc、Rd、Rg1和Re），而稀有人参皂苷（如F2、Rg3和CK）的含量很少[10]。这些人参皂苷的结构如图1A所示（基于[11]）。其中，人参皂苷CK作为一种关键的微生物代谢产物，在体内和体外研究中均表现出抗肿瘤活性[12]。个体间的这种体内生物转化效率存在显著差异。因此，通过体外转化直接制备易于吸收且高活性的稀有人参皂苷具有重要的研究价值[13]。此外，对天然分子进行合理的结构修饰可以显著优化其药理性质，例如降低毒性和提高溶解度[14]。

天然人参中稀有人参皂苷的含量极低[15]，直接从植物中提取在经济上不可行。在各种人参皂苷中，Rb1含量丰富，使其成为制备稀有人参皂苷的理想底物[16]。因此，核心科学挑战在于如何利用丰富的主要人参皂苷来定向合成稀有人参皂苷。传统的酸水解和热处理方法存在三个主要缺点：选择性低、副产物多以及环境影响大[17]、[18]、[19]。相比之下，使用β-葡萄糖苷酶（EC 3.2.1.21）的酶学策略因其高催化特异性而具有较大的潜力[20]。

这类酶能够通过精确水解末端β-糖苷键并依次去除C-3和C-20位置的糖基，实现主要人参皂苷向稀有人参皂苷的定向转化[5]、[21]。类似的分步切割机制也存在于来自Fervidobacterium pennivorans的超嗜热β-葡萄糖苷酶Fpglu1中，该酶首先水解外层的C-20 β-(1→6)糖苷键，随后切割内部的C-3键[22]。这些发现凸显了能够完全转化PPD型人参皂苷的细菌β-葡萄糖苷酶的多样性。尽管这类酶在通过水解β-糖苷提高植物活性苷元的生物利用度方面发挥重要作用，但益生菌来源的β-葡萄糖苷酶往往缺乏这种完全的催化能力。例如，Zhong等人报道的Lactobacillus brevis来源的β-葡萄糖苷酶（Bgy2）仅能将Rb1转化为Rd[23]；Hu等人表征的Bifidobacterium adolescentis来源的酶（BaBgl1A）可将Rb1和Rd转化为Gypenoside XVII（Gyp XVII）和F2[24]。这种无法完成多步转化的能力表明亟需具有更强催化能力的新型酶。

在本研究中，从Lacticaseibacillus rhamnosus中克隆出一种新型β-葡萄糖苷酶（Lrbgl）。如图1B所示，Lrbgl能够以60%的摩尔产率将Rb1高效转化为稀有人参皂苷CK，而大多数益生菌来源的β-葡萄糖苷酶仅能将Rb1转化为中间产物Rd。此外，Lrbgl还能将其他原人参二醇型人参皂苷（如Rd、Gyp XVII和F2）转化为CK。为了建立更经济可行的稀有人参皂苷生产过程，我们直接使用三七皂苷（PNS）作为复杂的底物进行酶促转化。实验结果表明，该酶能水解PNS中的多种主要人参皂苷，生成以CK为主要成分的稀有人参皂苷混合物。这项工作扩展了人参皂苷特异性β-葡萄糖苷酶的种类，并为高价值稀有人参皂苷的合成提供了一个高效、可持续的酶学平台，符合生物有机催化和天然产物价值化的目标。

化学品、菌株和质粒

异丙基-β-D-硫代半乳吡喃糖苷（IPTG）购自Solarbio（北京，中国）。p-硝基苯基糖苷（pNPG、pNPR、pNPX、pNPGal、pNPM）由Macklin Biotechnology Co., Ltd.（上海，中国）提供。人参皂苷标准品和三七皂苷（PNS，纯度≥98%）由Yuanye Biotechnology Co., Ltd.（上海，中国）提供。所有其他试剂均为分析纯，购自Sinopharm Chemical Reagent（上海，中国）。质粒pET24a和大肠杆菌

Rb1转化菌株的筛选与表征

我们筛选了具有Rb1转化能力的菌株。如图2A所示，L1和L5菌株表现出Rb1转化活性。其中，L5在培养Rb1时产生了两种不同的代谢产物（M1和M2），而L1仅产生一种代谢产物，经TLC分析初步鉴定为Rd。研究表明，糖基较少的人参皂苷在肠道中更容易吸收，可能具有更高的生物活性[8]。TLC分析

结论

本文鉴定出一种能够转化Rb1的Lactobacillus rhamnosus菌株，并从其基因组中克隆出一种新型β-葡萄糖苷酶Lrbgl。生化表征显示，Lrbgl是一种中温、弱酸性的酶（最佳pH 5.0–7.0），在40°C以下仍能保持稳定，并对多种金属离子和有机溶剂具有较好的耐受性，有利于生物催化。位点定向突变证实Asp232和Glu417是关键的催化位点

CRediT作者贡献声明

周晓雪：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，数据整理。李哲哲：研究，数据整理。熊磊：数据整理。周玉娟：数据整理。程颖：数据整理。曹璐：数据整理。胡海明：方法学研究，概念构思。高铁祥：形式分析，概念构思。刘洪涛：资源获取，概念构思。

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益冲突或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

本研究得到了湖北省中医药科学研究项目（编号：ZY2025L226）、湖北中医药大学重大项目（编号：2023ZDXM009）以及湖北中医药大学2023年重点项目（编号：2023ZZXLC001）的支持。