通过LC–ESI–MS/MS引导的体外和计算机模拟（in silico）研究，揭示了印度仙人掌（Opuntia ficus-indica）水提取物具有抗菌和α-淀粉酶抑制作用

《Bioorganic Chemistry》：Unveiling antibacterial and α-amylase inhibitory potentials of Opuntia ficus-indica aqueous extract through LC–ESI–MS/MS-guided in vitro and in silico investigation

本研究基于Tasquinimod设计合成28种新型1,2-二氢-4-羟基-2-氧代喹啉-3-羧酰胺衍生物，评估其细胞毒性并发现6g、7f、7g对肺癌、结肠癌、乳腺癌细胞及正常肺纤维细胞具有选择性抑制效果，通过细胞周期阻滞和线粒体功能紊乱机制阐释其抗癌活性，分子对接证实其与肿瘤相关蛋白高亲和力。

　　

尼图·玛丽亚姆·托马斯（Neethu Mariam Thomas）|阿努普·卡林加尔（Anoop Kallingal）|娜塔莉亚·马切耶夫斯卡（Natalia Maciejewska）|穆努加拉·钱德拉坎特（Munugala Chandrakanth）|迪帕克·B·萨伦克（Deepak B. Salunke）|尼古拉·彼得罗夫斯基（Nikolai Petrovsky）|瓦伦·塔昌·昆迪尔（Varun Thachan Kundil）|J. 阿比塔杰（J. Abhithaj）|马杰德·阿尔哈比（Majed Alharbi）|玛格达莱娜·纳拉伊奇克（Magdalena Narajczyk）|拉梅什·贡德鲁（Ramesh Gondru）|凯瑟琳·海瑟蒂娜·帕桑加（Catherine Healthina Pasangha）|贾纳尔丹·巴诺图（Janardhan Banothu）

印度喀拉拉邦科泽科德（Kozhikode）673601，卡利卡特国家技术学院（National Institute of Technology Calicut）化学系

摘要

本研究描述了以塔斯奎尼莫德（Tasquinimod）为骨架，设计和合成了28种新型1,2-二氢-4-羟基-2-氧代喹啉-3-羧酰胺衍生物。这些化合物对A549（肺癌）、HCT116（结肠癌）和MCF7（乳腺癌）细胞系以及非癌性MRC-5肺成纤维细胞系进行了细胞毒性评估，并与塔斯奎尼莫德进行了比较。除化合物8e（HCT116）、6b（A549）和5c（MCF7）外，所有衍生物的活性均高于塔斯奎尼莫德。化合物6g、7f和7g表现出广谱活性且对MRC-5细胞的毒性较低（IC₅₀ ≥ 100 μM），被选为机制研究的候选化合物。细胞周期分析和线粒体膜电位测定表明，强效化合物6g、7f和7g能够诱导细胞周期停滞并破坏线粒体功能。计算机模拟研究表明这些化合物具有很强的药物相似性。此外，对关键靶点的分子对接分析显示它们与相关癌症蛋白有良好的结合作用，进一步支持了其潜在的抗癌活性。总体而言，这些化合物是进一步体内评估和开发为新型抗癌药物的候选分子。

引言

癌症对全球健康的影响促使人们开发更多治疗方法。尽管在癌症治疗方面取得了显著进展，但由于化疗的广泛应用性、灵活性和成本效益，它仍然是最常用的治疗手段[1]。然而，现有的化疗方法存在缺点，包括药物耐药性的产生和由于缺乏特异性而导致的不良副作用[2]。

基于喹诺酮的杂环化合物显示出良好的抗癌活性[3]、[4]、[5]。这类化合物的核心骨架被用于多种潜在的化疗药物中，其作用机制包括诱导细胞凋亡、抑制血管生成、阻止细胞迁移和干扰细胞周期等[6]、[7]、[8]。沃雷洛辛（Voreloxin）和夸氟沙星（Quarfloxin）是正在进行临床试验的喹诺酮类小分子抗癌药物的例子[9]。在过去三十年中，喹诺酮衍生物的抗癌特性得到了充分研究，系统性的结构-活性关系（SAR）研究表明1,2-二氢-4-羟基-2-氧代喹啉核心结构具有开发抗癌药物的潜力。例如，罗奎尼梅克斯（Roquinimex，III，图1）是一种强效的1,2-二氢-4-羟基-2-氧代喹啉-3-羧酰胺衍生物，已进入癌症和多发性硬化症的临床试验[10]、[11]、[12]。由于其严重的心血管毒性[13]，罗奎尼梅克斯被结构改造为塔斯奎尼莫德（IV，图1）。塔斯奎尼莫德在一期和二期临床试验中显示出高疗效和良好的安全性[14]、[15]。尽管塔斯奎尼莫德的作用机制尚未完全明确，但其抑制血管生成、抑制巨噬细胞浸润和诱导细胞因子的作用可能对其抗癌活性有所贡献[16]。

1,2-二氢-4-羟基-2-氧代喹啉-3-羧酰胺类化合物（如罗奎尼梅克斯和塔斯奎尼莫德）的抗癌活性激发了人们对进一步改造这一骨架的兴趣。通过对塔斯奎尼莫德进行结构修饰，以提高其活性、毒性和药代动力学。在喹诺酮环的C-6位置引入氟原子获得了良好的效果[17]。据报道，这类氟喹诺酮类药物具有较低的毒性、较低的耐药性发展风险和更好的药代动力学特性[18]、[19]。因此，计划首先在喹诺酮环的C-6位置引入氟原子，并去除塔斯奎尼莫德的C-5甲氧基。此外，还改变了喹诺酮环的N-甲基取代基，以分析疏水相互作用对活性的影响。该方法还包括通过引入亚甲基延长C-3羧酰胺链，以提高分子的柔韧性。由于单个分子中存在多种有利结构可能产生有益的生物学效应[20]、[21]、[22]、[23]，因此还设计了将苯基替换为吡啶环的分子。

化学合成

化学合成

所需的1,2-二氢-4-羟基-2-氧代喹啉-3-羧酰胺衍生物通过四步合成路线制备，起始原料为5-氟异嗪（5-fluoroisatin，方案1）。第一步是在室温下，将5-氟异嗪（1）与烷基碘化物在碳酸钾（K₂CO₃）存在下，在二甲基甲酰胺（DMF）中反应6–12小时，生成相应的N-烷基-5-氟异嗪（2b-g）[24]。此步骤对于制备N未取代的衍生物是不必要的

结论

鉴定出一系列含有2/3/4-甲基吡啶和苄基取代基的新型6-氟-4-羟基-2-氧代-1,2-二氢喹啉-3-羧酰胺衍生物，这些化合物具有潜在的抗癌活性。这些分子通过四步合成策略从5-氟异嗪制备得到。体外细胞毒性评估显示，这些化合物对A549（肺癌）、HCT116（结肠癌）和MCF7（乳腺癌）具有抗癌潜力。其中，7f

化学方法

用于合成的化学品和溶剂均为分析级，购自Merck、SRL、TCI、Spectrochem和Alfa-aesar等商业公司。主要化合物塔斯奎尼莫德（Tasquinimod）购自Merck，按原样用于生物活性比较。反应通过涂有Merck硅胶60F-254板的薄层色谱法监测，结果在紫外光和/或碘蒸气下观察。合成的化合物

作者贡献

N.M.T. 在合作者的帮助下合成了所有目标化合物，进行了数据分析并起草了原始手稿。A.K.、N.M.和M.N.进行了生物测定。M.C.分析了单晶XRD数据。D.B.S.审阅了手稿并提供了宝贵建议。N.P.评估了化合物的TLR2和TLR8激动活性，并参与了手稿审阅。V.T.K.和A.J.进行了计算机模拟靶点鉴定和分子对接研究。

CRediT作者贡献声明

尼图·玛丽亚姆·托马斯（Neethu Mariam Thomas）：撰写初稿、方法学研究、数据分析。阿努普·卡林加尔（Anoop Kallingal）：撰写初稿、验证、方法学研究、数据分析。娜塔莉亚·马切耶夫斯卡（Natalia Maciejewska）：方法学研究、数据分析。穆努加拉·钱德拉坎特（Munugala Chandrakanth）：方法学研究、数据分析。迪帕克·B·萨伦克（Deepak B. Salunke）：撰写、审阅与编辑。尼古拉·彼得罗夫斯基（Nikolai Petrovsky）：撰写、审阅与编辑、方法学研究。瓦伦·塔昌·昆迪尔（Varun Thachan Kundil）：撰写初稿

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

作者尼图·玛丽亚姆·托马斯（Neethu Mariam Thomas）和贾纳尔丹·巴诺图（Janardhan Banothu）感谢DST-SERB提供的研究资助（DST编号：EEQ/2020/000303），以及卡利卡特国家技术学院（NIT Calicut）的创新、创业与孵化中心（CIEI）在2022–2023学年学生创新项目中的财务支持。穆努加拉·钱德拉坎特（Munugala Chandrakanth）感谢DST-INSPIRE（IF190417）提供的奖学金。贾纳尔丹·巴诺图（Janardhan Banothu）感谢卡利卡特国家技术学院院长提供的研究设施以及李宇鹏（Yupeng Li）博士的支持。