用于评估日本莲（Lotus japonicus）和豌豆（Pisum sativum）中固氮酶（nitrogenase）表达及根瘤菌（rhizobial）定殖情况的荧光生物报告基因

《Microbiology Resource Announcements》：Fluorescent bioreporters for assessing nitrogenase expression and rhizobial nodule occupancy in Lotus japonicus and Pisum sativum

根瘤菌中基于荧光蛋白的生物报告系统构建及验证。通过Golden Gate克隆技术整合nifH启动子与sfYFP、sfCFP、mScarlet-I荧光蛋白，成功开发监测根瘤形成和氮固定的多色报告系统，在Mesorhizobium japonicum和Rhizobium leguminosarum中均验证有效，并推荐5种高效质粒供社区使用。

　　

摘要

建立了一种基于 sfYFP、sfCFP 和 mScarlet-I 的生物报告系统，该系统用于 Mesorhizobium japonicum，以及基于 sfYFP 和 sfCFP 的系统用于 Rhizobium leguminosarum>，这些系统由 nifH 共识启动子驱动，用于监测豆科植物根瘤中的定殖和固氮事件。这些生物报告质粒将已建立的根瘤菌 sfGFP 系统扩展到了新的宿主和荧光蛋白上。

公告

在根瘤定殖过程中，一种固氮效率较低但竞争力较强的根瘤菌菌株可能会胜过一种固氮效率高但竞争力较弱的菌株，从而导致固氮作用减弱（1）。这使得竞争力成为根瘤菌共生的关键决定因素（2）。我们开发了一种基于质粒的菌株标记系统，通过量化根瘤中根瘤菌在固氮过程中表达的异源荧光信号来评估其定殖竞争力。此外，由固氮酶启动子驱动的荧光蛋白可以作为固氮酶活性的生物报告分子（1）。为了扩展这一领域的工具，我们将已建立的基于 sfGFP 的 NifH 生物报告系统从 Rhizobium leguminosarum bv. viciae 3841-Pisum sativum 的不定根瘤共生系统中扩展到包括额外的荧光蛋白（sfYFP 和 sfCFP）。我们还在能够形成定根瘤的菌株 Mesorhizobium japonicum R7A 和豆科植物 Lotus japonicus L. cv. Gifu 中重新建立了该系统。

通过 Golden Gate 克隆技术，将 nifH 启动子与来自 CIDAR 的荧光蛋白和转录终止子结合到 BEVA 复制质粒骨架中（4）（图 1，表 1）。我们使用了之前开发的 Rhizobium 共识启动子 Rlv_PsnifH（pOGG043）（1）和为 Mesorhizobium 新设计的合成共识启动子 Meso_PsnifH（pNDGG076）（表 1）（5）。这些质粒被整合到具有 par 复制原的 RK2 或 pBBR1 背骨中（图 1A）（4，6）。这些组件的 Golden Gate 组装遵循标准程序。通过接合将质粒引入根瘤菌（7，8），并通过将携带质粒的 R. leguminosarum 或 M. japonicum 接种到 P. sativum 或 L. japonicus 中来检测其在根瘤中的功能，随后进行荧光显微镜观察。在 Rhizobium 中已成功建立了类似的 sfGFP 生物报告系统（1）。在 Mesorhizobium 中，由于最佳质粒骨架不明确，我们通过 Meso_PsnifH sfGFP 在根瘤中的表达情况评估了 RK2 和 pBBR1 背骨的性能，发现 pBBR1（pNDMS157）的表现更优（图 1B）。利用 pBBR1 质粒骨架，我们生成了一系列新的质粒，这些质粒从 Meso_PsnifH 启动子（pNDMS237-239）和 Rlv_PsnifH 启动子（pNDMS290-292）表达异源荧光蛋白 sfYFP、sfCFP 和 mScarlet-I。我们发现这套质粒在分别用于 Lotus 和 Pea 的多菌株根瘤/固氮事件评估中非常有效（图 1C 和 D）。在配套的手稿中详细探讨了这些质粒的使用方法（5），发现除了 Rlv_PsnifH 驱动的 mScarlet-I 之外，这些质粒在混合接种实验中能够有效监测菌株身份和根瘤荧光水平。我们推荐用于社区研究的质粒（pNDMS237、pNDMS238、pNDMS239、pNDMS290 和 pNDMS291）已存入 Addgene。

图 1

图 1 使用 BioRender.com 设计的质粒图谱，显示了集成组件（表 1），以及不同质粒骨架表达 sfGFP 的根瘤荧光图，以及混合接种的 L. japonicus 和 P. sativum 根部的照片。（A）荧光报告质粒图谱显示了整体结构。该构建包含模块化的、可交换的启动子（Rlv_PsnifH 或 Meso_PsnifHB）使用 UV 透射仪（Bulldog Bio, Inc.）测量不同 M. japonicum 菌株携带生物报告系统的根瘤荧光水平，这些菌株具有两种质粒骨架：pNDMS156（pNDGG003）和 pNDMS157（pNDGG004），并与非荧光菌株 R7A 进行比较。（C）混合接种了表达 sfYFP、sfCFP 和 mScarlet-I 的 M. japonicum 菌株的 L. japonicus 根瘤。（D）使用 Cytation 5（BioTek）系统根据 Gautam 等人的方法（5）对 P. sativum 根瘤进行成像。

表 1

表 1 荧光质粒和 Golden Gate 组件

以 pNDGG003 为骨架的第 1 级 Golden Gate 克隆，包含部分组件：Meso_PsnifH-sfGFP-T2m；Tc^R以 pNDGG004 为骨架的第 1 级 Golden Gate 克隆，包含部分组件：Meso_PsnifH-sfGFP-T2m；Tc^R以 pNDGG004 为骨架的第 1 级 Golden Gate 克隆，包含部分组件：Meso_PsnifH-sfYFP-T2m；Tc^R以 pNDGG004 为骨架的第 1 级 Golden Gate 克隆，包含部分组件：Meso_PsnifH-sfCFP-T2m；Tc^R以 pNDGG004 为骨架的第 1 级 Golden Gate 克隆，包含部分组件：Meso_PsnifH-mScarlet-I-T2m；Tc^R以 pNDGG004 为骨架的第 1 级 Golden Gate 克隆，包含部分组件：Rlv_PsnifH-sfYFP-T2m；Tc^R以 pNDGG004 为骨架的第 1 级 Golden Gate 克隆，包含部分组件：Rlv_PsnifH-sfCFP-T2m；Tc^R以 pNDGG004 为骨架的第 1 级 Golden Gate 克隆，包含部分组件：Rlv_PsnifH-mScarlet-I-T2m；Tc^R以 pNDGG004 为骨架的第 1 级 Golden Gate 克隆，包含部分组件：Rlv_PsnifH-mScarlet-I-T2m；Tc^R

名称	描述	来源	AddGene 质粒编号
C3m	Superfolder 绿色荧光蛋白（sfGFP），Golden Gate 组件；Addgene CIDAR MoClo 第 1 卷扩展（试剂盒编号 #1000000161）；AmpR	Richard Murray 实验室：CIDAR MoClo 扩展（未发表）	120956
C51m	Superfolder 黄色荧光蛋白（sfYFP），Golden Gate 组件；Addgene CIDAR MoClo 第 1 卷扩展（试剂盒编号 #1000000161）；AmpR	Richard Murray 实验室：CIDAR MoClo 扩展（未发表）	120975
C91m	Superfolder 蓝色荧光蛋白（sfCFP），Golden Gate 组件；Addgene CIDAR MoClo 第 1 卷扩展（试剂盒编号 #1000000161）；AmpR	Richard Murray 实验室：CIDAR MoClo 扩展（未发表）	120999
C99m	mScarlet-I，Golden Gate 组件；Addgene CIDAR MoClo 第 1 卷扩展（试剂盒编号 #1000000161）；AmpR	Richard Murray 实验室：CIDAR MoClo 扩展（未发表）	121003
pNDGG003	BEVA 2.0 第 1 级 Golden Gate 克隆载体，带有 Bsa1 可交换的 lacZ，RK2 复制原和 par 稳定性，TcR	(6)	231316
pNDGG004	BEVA 2.0 第 1 级 Golden Gate 克隆载体，带有 Bsa1 可交换的 lacZ，pBBR1 复制原和 par 稳定性，TcR	(6)	231317
pNDGG037	BEVA 2.0 T2m 终止子，带有 DF 扩展的 CIDAR MoClo GG；SpR	(6)	231337
pOGG043	合成 Rhizobium PnifH Golden Gate 组件 Rlv_PsnifH；SpR	(1)	133123
pNDGG076	合成 Mesorhizobium PnifH PU/AB Golden Gate 组件 Meso_PsnifH；AmpR	本工作（5）	NAa
pNDMS156	本工作	NA
pNDMS157	本工作	NA
pNDMS237	本工作	248095
pNDMS238	本工作	248094
pNDMS239	本工作	248096
pNDMS290	本工作	248097
pNDMS291	本工作	248098
pNDMS292	本工作	248098
pNDMS292	本工作	NA

^a

NA 表示在 AddGene 中不可用。

根瘤荧光水平的统计显著性（图 1B）使用 GraphPad Prism（版本 10.5.0）进行单因素方差分析（ANOVA），随后进行 Dunnett 多重比较测试，结果相对于 R7A 野生型对照显示。P < 0.05。

致谢

本研究的资金由 New Innovator in Food & Agricultural Research (FFAR) 奖项（BAG ID: FF-NIA21-0000000061）提供。B.M.P.、B.A.G. 和 A.B.P. 由 USDA/NIFA 的 Specialty Crop Block Grant 22-242 资助。B.M.P. 还获得了 USDA/NIFA 的 hatch 资金 7009493 和 ND02438 的支持。B.A.G. 还获得了 USDA/NIFA 的 hatch 资金 ND02439 的支持。

我们感谢研究专家 Megan Ramsett 以及北达科他州立大学 Thomas Glass Biotech Innovation Core Lab 的 Scott Hoselton 的技术支持。