一种不含质粒、不含抗生素且无需诱导剂的工程大肠杆菌菌株，用于高效合成2’-岩藻糖乳糖

《Bioresource Technology》：Engineering plasmid-free, antibiotic-free, and inducer-free Escherichia coli strain for efficient 2′-fucosyllactose biosynthesis

2'-岩藻糖乳糖（2'-FL）是母乳中最丰富的 oligosaccharide，本研究通过模块化代谢工程策略，在无质粒大肠杆菌中显著提升2'-FL产量。优化乳糖利用途径和 GDP-L-岩藻糖合成，筛选高活性α1,2-FucT（WPfutC）并通过膜结合区域截短提升催化效率，构建人工ManC-Ndk多酶复合体增强关键酶表达和辅因子再生。最终工程菌株在 fed-batch发酵中实现108.3 g/L的2'-FL产量，产率达1.18 g/L/h，为可持续工业化生产提供新策略。

　　

李秉林|刘志强|刘彦峰|李江华|杜国成|吕学勤|徐先浩|刘龙

教育部碳水化合物化学与生物技术重点实验室，江南大学，中国江苏省无锡市214122

摘要

2′-岩藻糖（2′-FL）是最丰富的人乳寡糖（HMO），具有公认的健康益处，可以通过微生物发酵高效合成。然而，大多数报道的高产菌株仍然依赖于质粒表达系统，这带来了遗传不稳定性和抗生素污染的风险。相比之下，由于α-1,2-岩藻糖转移酶（α1,2-FucT）的途径通量不足和催化活性有限，在无质粒菌株中实现高水平的2′-FL生产仍然具有挑战性。在此，我们构建了一种无质粒、无抗生素、无需诱导剂的大肠杆菌（Escherichia coli）菌株，用于高效合成2′-FL。采用模块化代谢工程策略，通过改善乳糖利用和GDP-岩藻糖（GDP-l-fucose）的生物合成来增加前体供应。为了消除不希望产生的副产物双岩藻糖（DFL），我们鉴定了一种高效α1,2-FucT（WPfutC），并通过合理截短其膜相互作用区域进一步提高了其催化性能。此外，通过构建人工多酶复合物优化了关键途径基因的表达和辅因子再生。最终菌株WPL在摇瓶培养中产生了25.6 g/L的2′-FL，在 fed-batch 发酵中产生了108.3 g/L的2′-FL，产率为1.18 g/L/h，达到了无质粒菌株中报道的最高产量。这项工作为2′-FL的可持续工业生产提供了一种有前景的策略，并为其他HMOs的高效无质粒生产菌株的合理设计提供了见解。

引言

母乳被广泛认为是婴儿的理想营养来源，提供了对生长发育至关重要的必需营养素和生物活性化合物（Zhu等人，2024年）。在这些成分中，人乳寡糖（HMOs）占第三大固体成分，其中2′-岩藻糖（2′-FL）约占总HMOs的30%。作为一种由岩藻糖（l-fucose）、半乳糖（d-galactose）和葡萄糖（d-glucose）组成的中性岩藻糖寡糖，2′-FL具有多种生理益处，包括促进有益肠道菌群的定植、防止病原体附着、增强肠道屏障完整性和支持认知发展（Bych等人，2019年；Chen等人，2024年；Yang等人，2025年；Vazquez等人，2016年）。鉴于其安全性和有益特性，2′-FL已获得世界各地主要监管机构的批准，并被广泛用作婴儿配方奶粉和其他功能性食品中的营养补充剂。

为了满足对2′-FL日益增长的需求，开发高效且可扩展的生产技术已成为主要的研究焦点。与化学合成和酶促合成相比，后者由于总体产量低和前体成本高而受到限制，而通过发酵进行微生物从头（de novo）生物合成则是一种更可持续且经济上可行的策略（Petschacher和Nidetzky，2016年；Niharika和Singh，2025年）。近年来，已在多种微生物宿主中成功实现了2′-FL的从头生物合成，包括大肠杆菌（Escherichia coli）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum）和酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）（Li等人，2025a；Lin等人，2022年；Zhang等人，2022年）。其中，大肠杆菌由于其代谢网络明确和成熟的发酵工艺而成为主要的生产平台。在大肠杆菌中，2′-FL产量的显著提高主要依赖于基于质粒的表达系统。这些方法通常使用高拷贝数的质粒来放大途径基因的剂量，从而补偿α1,2-岩藻糖转移酶（α1,2-FucT）的固有限制性催化效率，该酶催化从头2′-FL生物合成的最终步骤（Li等人，2025b）。通常使用可诱导的启动子将细胞生长与2′-FL生物合成解耦，从而提高产物产量。在这种基于质粒的表达系统中，2′-FL的产量已超过100 g/L，最高报道值达到141.27 g/L（Chen等人，2023年；Wang等人，2023年；Li等人，2025c）。

尽管取得了这些进展，多拷贝质粒会带来较大的代谢负担，影响遗传稳定性，并需要持续补充抗生素和化学诱导剂。这些限制提高了生产成本，引入了生物安全问题，并降低了工业规模发酵过程中的工艺稳定性（Meng等人，2024年）。为了解决这些限制，已经开发了基于染色体整合的无质粒策略（Chen等人，2023a）。尽管基因组整合提高了遗传稳定性并消除了对抗生素的依赖性，但基因剂量的减少往往导致途径通量不足，使得α1,2-FucT的有限催化效率更加受限。此外，染色体整合的途径通常由组成型启动子驱动，这可能会加剧细胞生长与产物形成之间的资源竞争（Liu等人，2025年）。总的来说，这些内在的权衡限制了无质粒系统中2′-FL的高效生物合成，其产量通常明显低于基于质粒的系统（Chen等人，2023b；Zhang等人，2022年）。因此，在完全无质粒的背景下实现工业相关的2′-FL生产仍然是一个重大的代谢工程挑战。

因此，本研究旨在构建一种无质粒、无抗生素、无需诱导剂的大肠杆菌菌株，用于高效合成2′-FL。首先采用模块化代谢工程策略建立了从头2′-FL生物合成途径。为了克服低催化效率并防止DFL的形成，筛选并系统地通过截短膜相互作用区域工程化了高活性和底物特异性的α1,2-FucT。随后，设计了一种人工多酶复合物来增强关键途径基因的表达并促进辅因子的再生。这些发现为2′-FL的绿色和可持续工业生产提供了宝贵的见解。图1A展示了2′-FL生物合成途径和所采用的代谢工程策略的示意图。

化学品和试剂

2′-FL和DFL标准品购自J&K Scientific（北京，中国），除非另有说明，所有其他化学品均来自新华药业集团（上海，中国）。DNA聚合酶和一步克隆试剂盒购自Vazyme（南京，中国）。DNA凝胶纯化和质粒提取试剂盒购自Thermo Fisher Scientific（马萨诸塞州沃尔瑟姆）或Sangon（上海，中国）。用于重组菌株和质粒构建的氨苄西林（100 μg/mL）和壮观霉素...

通过CRISPR基因组编辑和模块化代谢工程实现2′-FL的从头生物合成

大肠杆菌MG1655具有天然的GDP-岩藻糖生物合成途径，理论上可以通过引入外源α1,2-FucT并以乳糖作为受体底物来生产2′-FL（图1B）。因此，将来自幽门螺杆菌（Helicobacter pylori）的futC基因（AAC99764.1）的一个拷贝整合到染色体中，并删除了lacZ基因以防止乳糖降解，从而生成了MGF2菌株（Lin等人，2022年）。然而，在MGF2中未观察到可检测到的2′-FL产生...

结论

在这项研究中，我们通过系统的组合代谢工程策略建立了一种无质粒、无抗生素、无需诱导剂的大肠杆菌平台，用于高效合成2′-FL。通过筛选和工程化高选择性的α1,2-岩藻糖转移酶（WPfutC），优化GDP-岩藻糖的供应，并构建ManC–Ndk人工多酶复合物以增强前体和辅因子的可用性，显著提高了2′-FL的产量。最终菌株的产量达到了...

未引用的参考文献

Agoston等人，2019年；Deng等人，2021年；Liu等人，2022b年。

CRediT作者贡献声明

李秉林：撰写 – 原稿撰写；数据整理。 刘志强：数据整理。 刘彦峰：撰写 – 审稿与编辑。 李江华：撰写 – 审稿与编辑。 杜国成：撰写 – 审稿与编辑。 吕学勤：撰写 – 审稿与编辑。 徐先浩：撰写 – 审稿与编辑；监督；资金获取。 刘龙：撰写 – 审稿与编辑；监督；资金获取。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的竞争性财务利益或个人关系。

致谢

本工作得到了中国国家重点研发计划（2024YFA0918300）、国家自然科学基金（32400054）、江苏省基础研究计划（BK20253060）、中央高校基本科研业务费（JUSRP202501009、JUSRP202404017、JUSRP622004）以及江苏省合成生物学基础研究中心（BK20233003）的财政支持。