通过混合核磁共振-计算策略识别功能热点，以实现大型酶的定向进化

《Bioresource Technology》：Identification of functional hotspots via hybrid nuclear magnetic Resonance-Computational strategy for directed evolution of large enzymes

本研究开发了一种混合NMR-计算策略，通过化学位移扰动图谱与AlphaFold3距离约束结合，无需完整核磁共振谱图即可定位大型酶的功能热点。以近90kDa的Pyrococcus furiosus DNA聚合酶（PfuPol）为例，成功鉴定四个空间上分布不同的催化热点，靶向饱和突变后获得多倍数催化效率提升，同时仅探索总序列的0.6%突变体。该策略有效缩小定向进化搜索空间，突破传统NMR方法在大型酶体系中的局限性，为工业酶优化提供高效工具。

　　

陈一豪|周功|赵晓玲|阿里·拉扎|朱明军|陶志清|李文辉|张旭|刘梅莉|何立春

中国科学院武汉国家磁共振中心磁共振光谱与成像国家重点实验室，精密测量科学技术创新研究院，中国武汉430071

摘要

定向进化彻底改变了酶工程领域，但对于大型多结构域蛋白质而言，由于其复杂的动态特性和庞大的序列组合空间，这一方法仍然具有挑战性。传统的核磁共振（NMR）光谱技术虽然能够有效识别功能性残基，但由于需要完整的共振 assignments，而在高分子量系统中这一过程变得非常困难。在此，我们提出了一种结合 NMR 和计算方法的框架，该框架将化学位移扰动映射与 AlphaFold3 嵌合的距离约束相结合，从而无需完整的共振 assignments 即可识别和定位配体附近的活性位点。通过分析侧链 ¹H–¹³C 相关谱、概率氨基酸类型鉴定以及结构邻近性筛选，我们在约 90 kDa 的 Pyrococcus furiosus DNA 聚合酶中定位了活性位点。对这些位点进行靶向饱和突变后，催化效率提高了数倍，而仅突变了总残基数的不到 0.6%。研究结果表明，这些活性位点在空间上具有独特性，但它们在催化过程中能够协同作用，这一点也得到了组合突变和动力学分析的支持。这种混合策略为在催化条件下缩小大型酶的突变目标范围提供了实用的方法，克服了传统 NMR 导向进化的尺寸、分配和筛选限制，通过优先考虑高概率的靶标残基，为高效生物催化剂的设计提供了有力途径。

引言

经过数亿年的进化，天然酶已经形成了适合生物体生存的功能核心，但它们并不一定在工业条件下对特定化学反应具有最高的催化效率（Sheldon 和 Woodley, 2018; Lovelock 等, 2022; Lister 等, 2025）。因此，研究人员不再局限于发现天然酶，而是积极设计针对特定应用的酶（Arnold, 2018）。为此，定向进化作为一种强大策略应运而生，旨在通过提升关键生物催化性质（如稳定性、活性和选择性）来克服催化效率不足、底物范围狭窄以及在非生理条件下的稳定性差等问题（Forget 等, 2025; Sun 等, 2022; Bell 等, 2022; Zhang 等, 2022）。这些进展促进了工程酶的广泛应用，从而彻底改变了生物技术和生物医学研究等领域（Turner, 2009; Hafeez 等, 2020）。因此，开发适用于广泛情况的定向酶工程方法具有重要意义。然而，由于天然酶的高分子量、多结构域特性以及复杂的底物结构，对其进行进化仍然具有挑战性（Soskine 和 Tawfik, 2010; Geddie 和 Matsumura, 2004）。即使已知底物结合口袋的位置，对覆盖该口袋的所有残基进行突变仍需要大量时间，更不用说随之而来的组合爆炸性问题（Wang 等, 2021）。此外，酶的催化活性还依赖于动态的残基相互作用，而不仅仅是静态的活性位点（Otten 等, 2020; Acevedo-Rocha 等, 2021; Bhattacharya 等, 2022; Gutierrez-Rus 等, 2025; Marshall 等, 2023）。因此，如果没有高通量筛选能力，对大量突变库的实验分析将需要巨大的资源，尤其是在处理大型酶的组合复杂性时（Zhang 等, 2022; Marshall 等, 2023; Yu 等, 2022）。因此，缩小序列搜索空间至关重要，这推动了许多方法的发展，以设计有针对性的突变库来指导定向进化（Bhattacharya 等, 2022; Gutierrez-Rus 等, 2025; Marshall 等, 2023; Khersonsky 等, 2018; Wijma 等, 2015）。

在这种情况下，核磁共振（NMR）光谱提供了一种互补策略，它能够在催化条件下直接分析催化参数和特定残基的化学环境（Otten 等, 2020; Bhattacharya 等, 2022; Hu 等, 2021）。通过研究溶液中的酶的 apo- 和 holo- 状态，NMR 可以捕捉到活性位点，从而将进化工作集中在与催化相关的残基上，促进酶的定向进化（Bhattacharya 等, 2022; Gutierrez-Rus 等, 2025）。此外，NMR 光谱还可以解析酶在含有辅因子的催化条件下的特定残基化学环境（Mainz 等, 2013）。特别是 2D [¹³C,¹H]-异核多量子相干（HMQC）实验是一种强大的工具，可以探测疏水核心和功能位点的化学环境（Tugarinov 等, 2007; Ruschak 和 Kay, 2010; Korzhnev 等, 2004），使其特别适合用于定向进化研究中的关键活性位点检测。这是因为疏水残基的甲基对局部构象变化非常敏感，即使在大型分子系统中也能揭示蛋白质动态或别构网络的微妙变化。然而，对这些活性位点的分配仍然具有挑战性，尤其是对于大型酶而言，由于快速的横向弛豫速率，标量磁化转移效率较低（Frueh, 2014）。尽管可以使用甲基-横向弛豫优化光谱（TROSY）NMR 或稀疏核奥弗豪泽效应（NOE）等方法来处理大型系统，但这些方法通常需要复杂的同位素标记方案或预先获取 NOE 数据，从而增加了复杂性和成本。因此，迫切需要更有效的分配方法来促进大型酶活性位点的 NMR 分析。

在这里，我们开发了一种结合 NMR 和计算方法的混合策略，用于定位活性位点并指导大型酶的定向进化。该方法将 NMR 得出的化学位移扰动（CSPs）与计算得出的距离约束相结合，通过匹配 CSPs 和距离约束并推导结构信息，预测并分配关键活性位点，为无法进行完整 NMR assignments 的情况提供了替代方案。我们以来自嗜热古菌 Pyrococcus furiosus（PfuPol）的高保真度 DNA 聚合酶（分子量约 90 kDa）作为模型系统（Lundberg 等, 1991）。成功定位了 PfuPol 中不同空间区域的活性位点，有效缩小了序列搜索范围。对这些活性位点进行饱和突变后，生物催化功能得到了显著提升，证明了这种综合方法在大型酶定向进化中的可行性和有效性，为酶功能和进化的新基础研究奠定了基础。

部分摘要

蛋白质的克隆、表达和纯化

PfuPol 的基因由 Sangon Biotech Co., Ltd.（中国）进行密码子优化和合成，并克隆到改良的 pET16b 向量中（Novagen）。PfuPol 的突变体通过文库筛选获得（见第 2.4 节），或通过定点突变 PCR 生成（见补充材料）。纳米抗体 Nb2 和 Nb4 的基因被克隆到含有 N-末端 His 标签的改良 pET22b 向量中（Tao 等, 2024）。相应的质粒被转化到 BL21（DE3）感受态细胞中

混合 NMR-计算策略和工作流程

包括酶在内的蛋白质的 NMR 定向进化通常依赖于目标蛋白质的完整共振 assignments。然而，对于大型酶来说，实现完整的共振 assignments 非常困难。因此，为了利用 NMR 辅助识别活性位点，我们开发了一种结合了五个连续步骤的混合 NMR-计算方法：(a) 通过添加底物后，利用 NMR 光谱得到的 ¹H–¹³C 化学位移扰动来确定催化活性位点

结论

我们开发了一种结合 NMR 实验和计算距离约束的混合 NMR-计算方法，用于定位活性位点并指导大型酶的定向进化。将这种方法应用于多结构域的 PfuPol 后，我们成功分配了四个实验确定的活性位点，证明了将距离约束与 CSPs 分析相结合以分配大型酶活性位点的可行性。定向进化验证了这些活性位点的催化作用

CRediT 作者贡献声明

陈一豪：撰写 – 原稿撰写、可视化、方法学设计、实验研究、数据分析、概念构建。周功：方法学设计、数据分析。赵晓玲：数据验证、实验研究。阿里·拉扎：数据验证、实验研究。朱明军：实验研究。陶志清：资源获取。李文辉：数据验证。张旭：资源获取、资金筹措。刘梅莉：项目监督、资金筹措。何立春：撰写 – 审稿与编辑、项目监督、资金管理

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

本研究得到了 中国科学院的战略优先研究计划（XDB0540000）、国家自然科学基金（资助编号 22574164、22174151 和 22327901）以及 湖北省自然科学基金（资助编号 2023AFA041）的支持。