来自日本的Zoysia mosaic病毒的完整基因组序列

《Microbiology Resource Announcements》：Complete genome sequence of Zoysia mosaic virus from Japan

日本割草草分离的Zoysia mosaic virus（ZoMV-TCG）完整基因组通过纳米孔测序确定，与之前Manila grass的ZoMV-ZM864株核苷酸相似度约80%，确认属于Poacevirus属。基因组长度9766 nt，含单一大ORF编码多聚蛋白，并存在转录滑移形成的P3N-PIPO和P3N-ALT小ORF。

　　

摘要

我们报告了来自日本草坪草的Zoysia mosaic virus (ZoMV) 的完整基因组序列。该病毒与先前报道的来自Manila grass的ZoMV-ZM864分离株具有约80%的核苷酸同源性。

公告

Zoysia mosaic virus (ZoMV) 是导致Zoysia草出现花叶症状的病原体。该病毒首次在日本被报道是在50多年前(1)。最初，根据病毒颗粒的形态特征，它被认为属于Potyvirus属。然而，在2023年，对从日本出口到美国的Manila grass (Zoysia matrella) 中获得的ZoMV-ZM864分离株（DDBJ/ENA/GenBank登录号OP425115)进行测序后，发现该病毒属于Potyviridae科和Poacevirus属(2)。在这项研究中，我们确定了2022年在栃木县那须塩原市采集的、感染日本草坪草(Z. japonicum)并表现出花叶症状的ZoMV (ZoMV-TCG) 的完整基因组序列。

使用含有纤维素D粉末(Advantec, Japan)的微旋柱(3)从有症状的日本草坪草中提取了双链RNA (dsRNA)。然后，利用模板切换RT酶混合物(NEB)以该dsRNA为模板、TSO (5′- AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACATrGrGrG-3′, rG: 鸟嘌呤核苷酸，下划线表示根据协议中的通用序列：https://www.neb.com/ja-jp/protocols/5-race-protocol-using-the-template-switching-rt-enzyme-mix)和引物TSO-F1-N6 (5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTTACANNNNNN-3′)合成了互补DNA (cDNA)。由于合成的cDNA在其5′端包含一个通用序列，在其3′端包含与该通用序列互补的序列，因此使用AUAP-TSO-F1-in5引物(5′-GGCCACGCGTCGACTAGTACACAGTGAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3′)进行了KOD One (TOYOBO, Japan) PCR反应。扩增产物使用NucleoSpin Gel和PCR Clean-Up Kit (Takara Bio, Japan)进行纯化，随后使用ligation sequencing DNA V14 (SQK-LSK114, Oxford Nanopore Technologies (ONT), UK)进行连接，并通过MinION Mk1B和Flongle Flow Cell (R10.4.1) (ONT)进行全基因组测序，生成了465,063条读段（平均读段长度：1,241.3 bp）。使用Cutadapt提取了同时包含预期5′和3′末端接头序列的纳米孔测序读段（允许的错误率为10%），并丢弃了缺少任一端接头的读段(4)。经过接头过滤的读段进一步使用NanoFilt进行质量和长度过滤（最小Q10值和200 bp长度(5)。过滤后的读段直接使用minimap2 (6)映射到ZoMV-ZM864，然后使用Racon进行一轮一致性校正(7)。除非另有说明，否则这些分析均使用默认参数。

ZoMV-TCG的完整基因组长度为9,766个核苷酸(nt)，不包括3′端的poly(A)尾，其鸟嘌呤或胞嘧啶(GC)含量为40.3%。映射到ZoMV序列的序列的平均基因组覆盖率为6,666.42倍。与ZoMV-ZM864类似，使用GENETYX-MAC v22.0.5预测到一个大型开放阅读框(ORF)，其长度为191–9,565 nt，编码一个353.9 kDa的多聚蛋白(图1)。该多聚蛋白包含九个潜在的potyvirus切割位点，与先前报道的ZoMV-ZM864分离株一致。此外，还预测到两个较小的ORF，称为P3N-PIPO(9)和P3N-ALT(10)，它们可能是由于GA₈基序(nt 3,090–3,098)处的转录滑动产生的产物。使用MUSCLE算法(11)在GENETYX-MAC中默认参数下对ZoMV-ZM864进行了序列比对。ZoMV-TCG的多聚蛋白ORF具有79.6%的核苷酸同源性和90.6%的氨基酸同源性。根据Potyviridae科的分类标准(12)，确认ZoMV-TCG是ZoMV的一个分离株。

图1

图1 Zoysia mosaic virus-TCG的示意图，显示了多聚蛋白和成熟蛋白质产物。ZoMV多聚蛋白中的潜在切割位点在基因组下方标出。红色字母表示ZoMV-TCG和ZoMV ZM864分离株之间的差异。

致谢

ZoMV感染的植物材料由Takao Tsukiboshi博士（国立农业食品研究组织[NARO]畜牧与草地科学研究所）提供。我们还要感谢Utsunomiya大学的Masayo Nakamura女士在文库制备和MinION设备操作方面提供的帮助。