A型血友病（HA）是一种X连锁隐性遗传性出血性疾病，表现为凝血因子VIII（FVIII）功能异常或缺乏，发病率约为每5000名男性新生儿中有1例[1]。在血管损伤部位，活化的FVIII（FVIIIa）与活化的因子IX（FIXa）结合形成内源性tenase复合物，从而激活因子X（FX），生成凝血酶并形成纤维蛋白凝块[2]。严重HA患者（血浆FVIII活性<1%）常出现频繁、自发的无法控制的出血，尤其是关节出血，导致慢性关节病和严重的身体残疾[1]。患者还会经历疼痛、不适、自我护理问题、焦虑和抑郁，从而影响生活质量[3]。HA患者可以通过预防性或按需治疗来治疗，治疗方法包括输注血浆来源的FVIII（pdFVIII）或重组FVIII（rVIII）[1]。然而，pdFVIII和rVIII的半衰期相对较短（约12小时[4]），因此需要每周注射多次，并且由于促血栓形成风险，剂量必须严格控制。大约25-35%的HA患者会发展出FVIII抑制剂[5],[6]，这需要寻找替代疗法。一种新型疗法是双特异性单克隆抗体emicizumab，它可以绕过FVIII的作用机制[7],[8]。
在循环系统中，约98%的FVIII与VWF的D’D3结构域通过非共价键结合形成复合物，使FVIII的半衰期延长至12小时，而缺乏VWF时仅为2小时[9],[10]。VWF通过保护FVIII免受蛋白水解降解、不受控制的激活以及与脂蛋白相关清除受体的相互作用，在维持FVIII稳定性和止血过程中起关键作用[10],[11]。延长FVIII半衰期的方法之一是使用重组融合蛋白rFVIIIFc-VWF-XTEN（BIVV001），该蛋白由VWF的D’D3结构域与FVIII-Fc（FVIII与免疫球蛋白G的Fc部分）以及两个XTEN模块融合而成[12]。我们描述了一种重组VWF D’D3白蛋白融合蛋白（rD'D3-FP）及其变体，这些变体具有增强的FVIII结合能力，在多种动物模型中能够延长共同给药的重组单链B结构域缺失FVIII（rVIII-SingleChain）的半衰期[13],[14]。由于rD'D3缺乏促血栓形成区域，其剂量可以高于血浆来源的VWF（pdVWF）或重组VWF（rVWF）[13]。然而，白蛋白融合对rD'D3-FP的清除和回收机制以及半衰期延长的影响尚不完全清楚。
多项全基因组关联研究（GWAS）发现了与FVIII和/或VWF水平相关的清除受体基因，包括SCARA5（Scavenger受体A类，成员5）、STAB2（stabilin-2）、SIGLEC5（唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素5）和CLEC4M（C型凝集素结构域家族4，成员M）[15],[16],[17]。后续研究表明，这些清除受体参与血浆来源的VWF（pdVWF）的内吞和降解，从而可能影响VWF的半衰期[18],[19],[20],[21],[22]。其中，STAB2被认为在调节VWF/FVIII水平以及VWF/FVIII复合物的免疫反应中起重要作用[18]。
STAB2是一种H类清除受体，对肝素、透明质酸、糖胺聚糖和磷脂酰丝氨酸等多阴离子分子的溶酶体降解和清除至关重要[23],[24],[25],[26],[27],[28]。STAB2是一种I型跨膜糖蛋白，存在两种主要异构体，具有相似的配体结合特性：(1) 315-kDa的异构体（315 kDa-STAB2）和(2) 190-kDa的异构体，后者是通过Ser1136位点的蛋白水解产生的[29]。有趣的是，190-kDa-STAB2的表达水平是其全长异构体的两倍[30]。它主要表达在肝脏、脾脏和淋巴窦内皮细胞上，前者被认为是VWF和FVIII清除的主要场所[31]。
在这里，我们发现rD'D3-FP与STAB2的结合是通过融合蛋白的D’D3部分介导的，这促进了其在体内的内吞和随后的溶酶体降解。然而，白蛋白融合似乎通过使rD'D3与共表达FcRn和STAB2的细胞中的新生儿Fc受体FcRn结合，将rD'D3-FP导向内吞回收途径。白蛋白融合还可能阻碍rD'D3-FP与STAB2的结合，从而影响其清除。因此，我们确定了两种可能有助于高等物种中rD'D3-FP半衰期延长的机制。
