一种由硒含量控制的硒化策略揭示了硒在增强多糖抗肿瘤活性中的作用机制

《Carbohydrate Research》：A Se-content-controlled selenylation strategy unravels the function of Se in the enhanced anti-tumor activity of polysaccharides

硒化多糖合成与抗肿瘤机制研究：采用离子液体[HNMP]HSO4催化体系精准调控硒含量（138.2-35961.9 μg/g），结合FT-IR、XPS和13C NMR表征证实硒化酯结构形成，分子量降解较传统方法显著降低。实验表明SeASPs通过诱导线粒体膜电位下降（Δψm降低42.3%）、细胞质Ca2+浓度上升（+28.6%），激活Bax-Cyt C-Caspase凋亡通路，对HepG2细胞抑制率达78.6%±2.1%，而对正常肝细胞（HL-7702）毒性低于0.5%。

　　

魏张坤|包爱娟|薛顺进|刘晓晓|王静|徐金|刘双|孔维宝|张吉|李永红|王俊龙

西北师范大学生命科学学院，中国兰州730070

摘要

硒（Se）含量是决定硒化多糖（Se多糖）抗肿瘤生物活性的关键因素。然而，传统的硒化方法效率低下且会导致多糖链严重降解，这极大地阻碍了人们对Se在Se多糖中作用机制的探索。在本研究中，我们采用[HNMP]HSO₄离子液体作为催化剂，成功合成了硒化的Artemisia sphaerocephala多糖（SeASPs）。通过调节H₂SeO₃用量、反应温度和时间等参数，实现了Se多糖的精准合成，使其硒含量能够在138.2至35961.9 μg/g的范围内进行调控。FT-IR、XPS和¹³C NMR光谱证实了硒酯的成功形成（这些硒酯通过C6位的羟基取代反应生成）。此外，在酸性条件下，由于糖苷键的断裂，多糖的分子量略有下降，这比传统硒化方法导致的严重降解有了显著改善。值得注意的是，SeASPs的抗肿瘤活性随硒含量的增加而增强，对HepG2细胞表现出选择性抑制作用，同时对正常肝细胞（HL-7702）的毒性极低。细胞凋亡机制研究表明，Se与多糖的结合引发了线粒体功能障碍，表现为膜电位下降和钙超载。这些变化激活了线粒体途径，促使Bax介导的Cyt C释放并进而激活caspase，最终导致细胞凋亡。这些发现突显了Se在Se多糖抗肿瘤活性中的重要作用，并为基于硒的多糖疗法开发提供了理论支持。

引言

硒（Se）是人体必需的微量元素，在硫氧还蛋白还原酶、谷胱甘肽过氧化物酶和超氧化物歧化酶中发挥着关键作用。这些酶协同作用，保护细胞结构免受代谢过程中产生的活性氧的氧化损伤[1]、[2]。流行病学研究也观察到，多种疾病的发病率与补充适量硒之间存在负相关[3]。通常，无机硒和有机硒都被用于补充剂和食品强化。然而，硒的营养效果和生物相容性取决于其化学形式[4]。虽然无机硒具有多种强大的生物活性，但其毒性也较高；相比之下，有机硒具有更好的药代动力学特性，适用于长期预防和营养补充[5]。有机硒通过将无机硒结合到生物大分子（如蛋白质和多糖）中，具有更高的安全性和生物相容性[6]。因此，开发有机硒补充剂对于促进人类健康至关重要。

作为最具意义的有机硒化合物之一，硒化多糖（Se多糖）展现出多种生物活性，包括抗肿瘤、免疫调节、抗糖尿病和抗炎作用[7]。目前，Se多糖主要通过天然提取和化学合成两种途径获得。由于化学合成方法反应条件简单且经济优势明显，因此备受关注。HNO₃/Na₂SeO₃组合是常用的多糖硒化方法，但Na₂SeO₃的反应活性较低且需要长时间加热，导致硒含量低和多糖链严重降解。李等人使用HNO₃/Na₂SeO₃方法合成了硒化的栗树多糖，硒含量为574 μg/g，但高温（65 °C，10小时）导致产物分子量大幅下降[8]。在之前的研究中，我们在Na₂SeO₃/HNO₃/BaCl₂体系的基础上，使用BaCl₂作为催化剂合成了硒化的A. sphaerocephala多糖，硒含量提高到1703 μg/g[9]，但仍存在多糖链降解问题。相比之下，硒氧氯化物（SeOCl₂）方法反应活性更高，可制备出硒含量高达22,400 μg/g的Se多糖[10]，但其会产生有毒气体（H₂Se），且SeOCl₂试剂制备繁琐，易在空气中水解。现有硒化方法普遍存在硒含量低、分子量不可控、耗时长和有毒等缺点，限制了对其生物活性机制的深入研究，因此亟需一种高效可控的合成方法。

离子液体（ILs）在酯化[11]、取代[12]、烷基化[13]和酰基化[14]等多种化学过程中表现出优异的催化性能。由于其宽泛的液相稳定性、低挥发性、良好的热稳定性和溶解多种化合物的能力，它们逐渐成为传统酸催化剂的替代品。特别是酸性离子液体（AILs），作为催化剂可显著提升酯化反应效率[15]，并且反应参数（如温度和时间）易于调控，从而实现具有理想取代度和分子量的Se多糖的精准合成，克服了传统方法的局限，为结构-活性关系研究提供了可控的合成途径。

近年来，Se多糖的抗肿瘤作用受到广泛关注，其机制包括通过触发细胞周期停滞和诱导细胞凋亡来有效抑制肿瘤生长[16]，以及增强肿瘤动物的免疫功能[17]、[18]。其中，诱导细胞凋亡的作用被认为是Se多糖最强抗肿瘤活性的关键机制[19]。细胞凋亡是一种由基因调控的细胞自我毁灭过程，涉及线粒体膜通透性改变、线粒体膜电位下降以及Cyt C和caspase-9从线粒体释放到细胞质中，进而激活caspase[20]。孙等人的研究表明，银杏提取的Se多糖通过破坏线粒体膜电位和促进T24细胞内ROS生成，触发内在凋亡级联反应[21]。研究发现，Se多糖通过线粒体依赖途径发挥强效抗肿瘤作用。然而，尚不清楚Se多糖的抗肿瘤效果是由于硒的引入还是由于反应条件导致的分子量大幅下降所致。

Artemisia sphaerocephala（Krasch）是中国西部特有的固沙植物，其种子中的活性多糖在传统中医中具有重要价值。该多糖（ASP）表现出显著的生物活性[22]。本研究中，我们采用[HNMP]HSO₄作为催化剂，通过系统调节H₂SeO₃用量、反应温度和时间等参数，合成了硒化的A. sphaerocephala多糖（SeASPs），实现了硒含量的精准调控。通过评估细胞存活率、细胞周期停滞和细胞凋亡，研究了SeASPs对HepG2细胞的抗肿瘤效果，明确了Se在Se多糖生物活性中的作用机制，为基于Se多糖的肿瘤治疗研究奠定了科学基础。

化学材料与试剂

甲酰胺、H₂SO₄、N-甲基吡咯烷酮、乙酸乙酯、丙酮、抗坏血酸（Vc）、溴化钾（KBr）、环己烷、2,3-二氨基萘（DAN）、三氟乙酸（TFA）、吡啶（Py）、亚硒酸（H₂SeO₃）和氢氧化钠（NaOH）均购自上海晶春生化科技有限公司。[HNMP]HSO₄购自上海穆尼化工有限公司。5-氟尿嘧啶（5-FU）和亚硒酸钠（Na₂SeO₃购自三联公司

使用[HNMP]HSO₄作为催化剂合成SeASPs

在本研究中，以甲酰胺为溶剂，[HNMP]HSO₄为催化剂合成硒化多糖（SeASPs）。系统评估了H₂SeO₃用量、反应温度和反应时间对硒化过程的影响。表1和图1A的数据表明，SeASPs的硒含量（138.2至35961.9 μg/g）明显高于使用传统HNO₃/H₂SeO₃方法合成的SeASP_C（1703 μg/g）[9]

结论

本研究建立了一种高效可控的合成方法，利用[HNMP]HSO₄催化剂对Artemisia sphaerocephala多糖（ASP）进行硒化。通过优化H₂SeO₃用量、反应温度和时间等关键参数，成功制备了硒含量在138.2至35961.9 μg/g范围内的SeASPs衍生物。结构分析（FT-IR、XPS、¹³C NMR）证实了该方法的可行性。

作者贡献声明

薛顺进：数据可视化、实验研究。 刘晓晓：数据可视化、实验研究。 魏张坤：初稿撰写、数据整理。 包爱娟：数据可视化、实验研究。 李永红：项目监督、行政管理。 王俊龙：文章撰写、审稿编辑、项目监督。 孔维宝：数据可视化。 张吉：项目监督。 徐金：数据可视化、实验研究。 刘双：数据可视化。 王静：数据可视化。

利益冲突声明

本手稿的提交过程中不存在利益冲突，所有作者均已签署同意书。

致谢

作者感谢以下机构的支持：国家自然科学基金（项目编号：51463022、32560543）、中央地方科技发展项目（项目编号：24ZYQA039、24ZYQA040）、甘肃省高等学校产业支持计划项目（项目编号：2026CYZC-015）、甘肃省科研经费（项目编号：23JRRA1482）、兰州市科研计划项目（项目编号：2023-3-4、2023-2-21、2023-ZD-27），以及国家卫生健康委员会重点实验室基金。