《Cellular Signalling》：The p75NTR/Mdm2 signaling axis promotes odontogenic differentia-tion and mineralization in ectomesenchymal stem cells
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研究揭示了p75NTR与Mdm2在牙源性干细胞分化及矿化中的调控机制。通过建立p75NTR敲除小鼠模型及体外实验，发现p75NTR敲除导致Mdm2表达下降，而p75NTR过表达可显著上调Mdm2并促进EMSCs的牙源性分化及矿化相关基因（Dspp、Dmp1、Runx2、Opn）表达。荧光素酶报告基因与共免疫沉淀实验证实p75NTR在核内通过激活Mdm2基因转录及直接结合Mdm2蛋白发挥作用，形成正反馈环路调控牙本质形成。
Jingwen Mao|Xiaoming Pu|Lang Tian|Yingxin Chen|Yangjun Liu|Linyi Liu|Rui She|Guangping Wang|Xiujie Wen
中国四川省泸州市西南医科大学，邮编646000
摘要
牙齿的发育和再生依赖于牙源性干细胞命运的精确调控。随着干细胞组织工程和再生医学的进步，生物牙齿再生已成为再生医学的研究焦点。作为神经嵴来源的外胚间充质干细胞的阳性标志物，p75NTR在牙齿发育中起着重要作用。Mdm2是p53的关键负调控因子，与p75NTR具有功能关联。然而，p75NTR与Mdm2之间的相互作用及其在牙齿发育过程中的矿化作用仍不清楚。本研究探讨了p75NTR和Mdm2在牙源性分化和矿化中的作用及其调控关系。我们建立了p75NTR敲除小鼠模型以研究p75NTR对Mdm2的调控作用。使用从小鼠牙胚中分离出的外胚间充质干细胞（EMSCs）进行体外实验。结果表明，p75NTR敲除小鼠的牙组织中Mdm2表达降低，而在体外条件下p75NTR过表达显著上调了EMSCs中的Mdm2表达。此外，Mdm2增强了EMSCs中Dspp、Dmp1、Runx2和Opn的表达。荧光素酶报告基因实验和共免疫沉淀实验表明，p75NTR通过与核内Mdm2蛋白的相互作用增强了Mdm2基因的转录活性。进一步研究表明，p75NTR过表达逆转了Mdm2敲低对EMSCs牙源性分化和矿化的抑制作用。这些发现表明，Mdm2介导了p75NTR诱导的EMSCs牙源性和矿化过程，并且p75NTR在核内与Mdm2蛋白结合时激活了Mdm2的转录。
引言
牙硬组织主要由牙釉质、牙本质和牙骨质组成。其高度矿化对于维持牙齿的机械完整性、美观外观和长期健康至关重要[1]。牙硬组织的矿化是一个高度精确的过程，其特征是通过有机和无机成分的有序整合形成超微结构[2]，并受到复杂的生物信号网络的调控。外胚间充质干细胞（EMSCs）来源于颅神经嵴，是除牙釉质外所有牙硬组织的前体细胞[3]。EMSCs与牙源性上皮相互作用，促进牙齿形态和结构的发育，并最终分化为除牙釉质外的所有牙组织[4]。由于EMSCs被用作牙组织工程的种子细胞，因此了解其牙源性分化和后续矿化能力的详细分子机制对于推进牙组织再生研究具有重要意义。
p75神经营养因子受体（p75NTR）是肿瘤坏死因子受体超家族中的关键成员[5]。作为神经嵴来源干细胞的主要表面标志物[6]，p75NTR不仅在神经系统发育中发挥多种调控作用，还在启动牙齿发育以及牙源性干细胞的矿化和分化中起关键作用[7]、[8]。在牙胚发育的钟状期，p75NTR主要在EMSCs中表达[9]。其表达水平与细胞的体外矿化能力呈正相关[10]，并通过激活PI3K/Akt/β-连环蛋白信号通路促进EMSCs的牙源性分化和后续矿化能力[7]、[11]。然而，p75NTR在牙齿发育中的具体调控机制尚待阐明。
小鼠双分钟2（Mdm2）是一种原癌基因，作为含有RING结构域的E3泛素连接酶，在多种组织的谱系决定和分化中起关键调控作用。骨骼发育研究表明，Mdm2通过抑制p53活性来促进成骨细胞增殖、分化和骨形成，在骨骼发育中起决定性作用；其缺失会导致骨骼发育缺陷、骨量减少甚至死亡[12]、[13]、[14]、[15]。这些发现表明Mdm2促进生物矿化。在牙齿发育过程中，Mdm2在成牙细胞中高度富集，通过调节转录因子Dlx3及其下游靶基因Dspp来促进小鼠牙髓干细胞（mDPCs）向成牙细胞表型的分化，同时减轻p53对牙发育的抑制[16]。重要的是，p75NTR已被证明通过促进Mdm2介导的p53泛素化和降解来降低p53的稳定性[17]，这提示p75NTR与Mdm2之间存在潜在联系。然而，p75NTR与Mdm2之间的相互作用及其在牙齿发育过程中的矿化作用仍不清楚，需要进一步研究。
本研究的目的是进一步阐明p75NTR和Mdm2在牙齿发育过程中调控EMSCs牙源性分化和矿化中的作用及其机制。我们结合了体内和体外方法，包括对敲除小鼠牙齿切片的荧光成像、p75NTR或Mdm2的敲低和过表达实验、荧光素酶报告基因分析以及共免疫沉淀实验，来研究p75NTR/Mdm2信号轴在牙源性和矿化中的功能作用和分子机制。这些发现可能为优化基于EMSC的牙组织再生提供机制见解和潜在靶点。
实验动物
p75NTR敲除（KO，p75NTR?/?）小鼠来自中国的广州Cyagen Biotechnology有限公司。这些小鼠与野生型（WT，p75NTR+/+）小鼠杂交，生成杂合子小鼠（p75NTR+/?）。然后通过进一步杂交获得纯合子敲除小鼠。使用以下引物对WT和KO小鼠进行基因分型：WT小鼠的正向引物为5’-AAGAACTGCTGCATCTGAGCTGG-3′，反向引物为
外胚间充质干细胞的分离和鉴定
小鼠在出生后第1天被处死，解剖其上颌骨和下颌骨以获取磨牙胚（图1a，b）。通过酶消化成功分离并培养了EMSCs。光学显微镜观察显示（图1c），这些细胞呈均匀的纺锤形，类似于成纤维细胞。后续实验使用的是第三代细胞。流式细胞术分析（图1d）显示99.9%的细胞表达表面标志物CD29，0.47%和0.17%的细胞表达其他相关蛋白
讨论
牙齿组织的发育和再生依赖于牙源性干细胞命运的精确调控。外胚间充质干细胞（EMSCs）来源于颅神经嵴，具有多向分化潜能，是除牙釉质外所有牙组织的前体细胞[18]。阐明驱动EMSCs牙源性分化和矿化能力的分子信号网络不仅是发育生物学中的核心课题，也为相关研究提供了重要基础
结论
本研究阐明了p75NTR和Mdm2及其相互作用在EMSCs牙源性和矿化中的关键作用。通过体内和体外实验，我们证实p75NTR通过正向调控Mdm2表达来促进EMSCs的牙源性和矿化能力。荧光素酶报告基因实验和共免疫沉淀实验进一步证实了这两种蛋白之间的关系
动物实验批准
所有动物实验均获得了西南医科大学动物实验伦理委员会的批准（批准编号：20240829-014）。
作者贡献声明
Jingwen Mao：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，实验设计，数据分析。Xiaoming Pu：撰写 – 原稿，数据分析。Lang Tian：数据分析。Yingxin Chen：实验设计。Yangjun Liu：实验设计。Linyi Liu：数据分析。Rui She：数据分析。Guangping Wang：撰写 – 审稿与编辑，数据可视化，数据分析。Xiujie Wen：撰写 – 审稿与编辑，数据可视化，资金申请，数据分析。
资助
作者声明本文的研究、作者身份和/或发表获得了财务支持。本研究得到了四川省科技厅指导的“地方科技专项”（项目编号：2024ZYD0055）和四川省医学会（项目编号：S20028）的支持。
利益冲突声明
作者声明本研究未涉及任何可能构成利益冲突的商业或财务关系。
致谢
我们感谢西南医科大学的“细胞与分子生物技术公共平台”的大力帮助。同时，我们也感谢Biorender（网址：www.biorender.cn）在图表绘制方面的支持。
