通过对Crassostrea gigas（大蚝）中狐狸基因家族的全基因组鉴定和表达分析，揭示了该基因家族在性别决定过程中的潜在功能

《Comparative Biochemistry and Physiology Part D: Genomics and Proteomics》：Genome-wide identification and expression profiling of fox gene family reveals the potential functions of sex determination in Crassostrea gigas

太平洋牡蛎Fox基因家族基因组鉴定及性发育阶段表达特征分析，发现16个Fox基因分属13亚家族，其中FoxL2和FoxK2在雌雄性成熟阶段呈现显著差异表达，揭示Fox基因在软体动物性决定中的调控作用。

　　

陈思童|李琦|胡碧阳|杜少军

中国海洋大学教育部海洋养殖重点实验室，青岛，266003，中国

摘要

太平洋牡蛎（Crassostrea gigas）是全球主要的养殖贝类之一，具有重要的生态和经济价值。牡蛎的性别决定机制至今仍不完全清楚。Fox转录因子是调控关键生物过程的关键因子，控制着组织发育和繁殖等重要功能。本研究对C. gigas中的Fox基因家族进行了全基因组范围的鉴定和特征分析。通过系统鉴定，发现了16个Fox基因，并根据系统发育分析和保守结构域分析将其分为13个亚家族。转录组分析显示，在静止期FoxK2和FoxG1的表达显著上调；而在活跃的配子发生过程中，FoxG1在雌性和雄性中的表达水平差异显著（P<0.05）。FoxE1和FoxL2在雌性成熟期间表达升高，而FoxO、FoxN4和FoxK2在雄性成熟期间表达升高（P<0.05）。在产卵期，FoxE1和FoxK2在雌性中表达显著，而FoxJ1B和FoxK2在雄性中表达升高（P<0.05）。我们的发现表明FoxB1、FoxE1、FoxL2、FoxP1和FoxC1具有性别差异性的表达模式，并具有特定的生殖腺功能。我们的研究对于理解性别决定过程具有重要的生态学意义，并为双壳类动物中Fox基因的调控机制提供了新的见解。

引言

在进行有性繁殖的动物中，性别决定是一个基本的生物过程，由发育关键阶段的分子和内分泌事件驱动。（Wilhelm等人，2007；Kara，2025）。在脊椎动物中，Sox、Dmrt和Fox是一些被确定为性别决定关键调节因子的基因。Sry介导的Sox9上调标志着雄性性别决定的开始，随后激活Dmrt1（Raymond等人，1998；She和Yang，2017）。相比之下，雌性个体主要由Wnt4/β-连环蛋白信号通路调控，这对FoxL2的表达至关重要（Bertho等人，2016；Lundgaard等人，2024）。然而，关于Sox、Dmrt和Fox基因在无脊椎动物性别决定中的具体作用和分子机制的信息仍然有限。在节肢动物中的研究表明，Sox4和Sox5对决定雄性性别至关重要，而Sox14、Sox21和SoxB1可能调控雌性发育（Du等人，2019；Wan等人，2019）。在软体动物中，Dmrt3和FoxL2在雄性和雌性生殖腺的成熟阶段表达达到峰值，这表明它们可能在性别决定和生殖腺发育中起作用（Ning等人，2021；Yan等人，2023；Nicolini等人，2025）。尽管这些研究提供了关于特定基因在性别决定和生殖腺发育中功能的初步见解，但调控这些过程的机制仍不清楚。Forkhead-box（Fox）家族是调控脊椎动物生殖腺发育和性别决定的保守网络的重要组成部分，但在大多数无脊椎动物群体中的作用和组成仍不甚清楚。

作为转录因子超家族的成员，Fox蛋白通过称为“Forkhead结构域”的翼状螺旋DNA结合结构域进行相互作用。Forkhead结构域对于执行性别分化和性别决定的遗传程序至关重要。此外，Fox基因在胚胎发生、细胞增殖、组织特异性、寿命控制和生殖成熟等关键过程中发挥作用（Lehmann等人，2003；Coffer和Burgering，2004；Tuteja和Kaestner，2007a，Tuteja和Kaestner，2007b）。在包括人类（Kumar和Roy，2024）、肌肉鼠（Huang等人，2017）、尼罗河鲈（Yuan等人，2014）和优雅斑马鱼（Wu等人，2024）在内的脊椎动物中的先前研究表明，Fox基因是性别决定过程的参与者和调节因子。在模式动物中，FoxL2可以促进和维持雌性卵巢的发育并抑制Sox9的表达，使动物向雌性方向分化（Zhang等人，2014）。此外，研究还证实Fox基因是包括Mizuhopecten yessoensis（Nagasawa等人，2019）、Apostichopus japonicus（Sun等人）和Argopecten irradians（Wei等人，2021）在内的多种无脊椎动物性别决定的关键调节因子。然而，Fox基因在软体动物性别决定中的调控机制仍不清楚。

太平洋牡蛎（Crassostrea gigas）是一种广泛分布的双壳类软体动物，对海洋环境的生态和经济方面都有重要贡献。此外，C. gigas是研究性别决定的理想模型。通过测序分析发现，关键的性别决定基因位于不同的染色体上，且未检测到性染色体（Zhang等人，2014；Sun、Yu和Li，2023a，Sun、Yu和Li，2023b）。关于牡蛎性别决定背后的分子机制，尤其是相关基因的功能，仍存在显著空白。在C. gigas中，FoxL2和Dmrt1也被提出可能是参与因子（Yue等人，2018；Sun、Li和Yu，2022a，Sun等人，2022b，Sun、Yu和Li，2022c）。目前，牡蛎的性别决定机制尚不明确，涉及的调控基因也不清楚，C. gigas中Fox基因家族的全基因组鉴定工作也尚未完成。我们的研究对C. gigas中的Fox基因家族进行了全面的全基因组鉴定和综合分析。在多个组织和生殖腺发育的关键阶段对Fox基因的表达分析揭示了独特的转录动态，表明这些基因参与了C. gigas的性别决定过程。总之，我们的研究为理解Fox基因在软体动物性别决定中的作用提供了遗传支持，并加深了我们的认识。

样本收集

样本收集

2024年12月至2025年7月期间，每月在中国山东省 Rushan 收集了50只一岁的成年C. gigas》。提取的组织包括生殖腺、外套膜、鳃、消化腺和内收肌，然后将其冷冻在液氮中并储存在-80°C。使用苏木精-伊红（HE）染色法鉴定生殖腺的发育阶段，将生殖腺成熟分为四个阶段（图1）。生殖腺发育分为四个阶段：S0：静止期，S1：

Fox基因的全基因组鉴定和特征分析

在C. gigas中鉴定出16个含有Forkhead结构域的序列，并将其分为13个亚家族（表2）。Fox蛋白的长度范围为302至939个氨基酸。Fox蛋白的理论等电点范围为4.912至10.378，分子量范围为34.04至100.39 kDa。结构分析显示，Fox的二级结构主要由α-螺旋、无序卷曲和伸展链组成，没有β-折叠

讨论

Fox基因在调节性别成熟、寿命、细胞增殖和分化以及胚胎发育中起着关键作用（Lehmann等人，2003；Coffer和Burgering，2004；Tuteja和Kaestner，2007a，Tuteja和Kaestner，2007b）。Foxo1调节雄性小鼠精囊干细胞的维持（Tarnawa等人，2013）。敲低foxo1a、foxo3a和foxo3b会影响Cynoglossus semilaevis中与性别决定和精子发生相关的基因表达

结论

我们的研究系统地鉴定了C. gigas中的Fox转录因子家族的基因组水平。通过全面的系统发育分析，我们将16个Fox基因分为13个亚家族。此外，这些发现揭示了Fox基因家族在生殖腺发育四个阶段的转录动态，并确定FoxL2是可能参与C. gigas性别决定过程的关键候选基因。我们的研究为这一领域提供了新的见解

声明

本动物研究已由中国海洋大学审核批准。在本研究中，所有动物实验均遵循ARRIVE指南进行。

CRediT作者贡献声明

陈思童：撰写——原始草稿、调查、正式分析、数据管理。李琦：项目管理。胡碧阳：撰写——审稿与编辑。杜少军：项目管理。

未引用参考文献

Bailey, Johnson, Grant and Noblem, 2015

Chaboissier et al., 2004

Fritzenwanker, Gerhart, Freeman and Lowe, 2014

Gajiwala and Burley, 2000

Ge et al., 2018

Martijn, Jean-Christophe, Leo and Ido, 2023

Min et al., 2019

Schefe, Lehmann, Buschmann, Unger and Funke-Kaiser, 2006

Shi et al., 2024

Wang and Nie, 2024

Wang et al., 2022

Weber et al., 2020

Wei, Yang, Tao and Wang, 2016

Wijchers, Burbach and Smidt, 2006

Zeng et al., 2024

Zhang, Huang, Fu, Chen and Wang, 2024

Zhao et al., 2024

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

本工作得到了国家自然科学基金（W2411019）、青岛蓝种业创新项目（QDLYY-2024001）和广东现代海洋养殖候选物种育种技术研究（2024-MRB-00-001）的支持。