《Coordination Chemistry Reviews》：Design strategy and progress of fluorescence probes for selective sensing and imaging of biological thiols
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荧光探针系统综述生物巯基检测机制与应用进展，重点分析小分子探针的设计策略与化学原理，涵盖GSH、Cys、Hcy的荧光成像、选择性检测及在细胞与活体研究中的应用，并探讨技术挑战与未来方向。
郑阳|杨浩楠|应鹏|贾晓丹|刘向荣|刘萍|张生勇|李建利
西安科技大学化学与化学工程学院，中国西安710054
摘要
生物硫醇是重要的小分子生物调节剂，在许多关键过程中发挥着重要作用，并与多种严重疾病直接相关。因此，硫醇的传感和成像已成为研究重点。荧光探针为在细胞水平和体内研究活性硫醇的多方面作用提供了重要的工具，具有高灵敏度和选择性。本文系统概述了硫醇的荧光团、官能团和检测方法的分类及结构特性。我们重点介绍了用于敏感和选择性检测硫醇的小分子荧光探针的有趣进展，并强调了荧光探针设计背后的策略和化学机制，主要描述了其生物成像、诊断和治疗应用。最后，本文讨论了荧光探针面临的挑战及未来研究方向，以促进这些探针在生物医学研究和临床应用中的准确检测。
引言
生物硫醇，通常指谷胱甘肽（GSH）、半胱氨酸（Cys）和同型半胱氨酸（Hcy），在与健康和疾病状态相关的众多关键系统中扮演着多种生理和病理角色[1]、[2]、[3]、[4]、[5]。具体而言，由于含有巯基（-SH）这一活性中心，它们参与氧化还原反应、代谢调节、解毒和细胞保护[10]。它们不仅通过作为抗氧化剂在体内维持氧化还原平衡，还参与信号转导、基因调控和外源物质代谢等关键过程[6]、[7]、[8]、[9]。其中，Cys是一种含硫必需氨基酸，是蛋白质中二硫键（-S-S-）的结构基础，维持酶、抗体等蛋白质的结构和功能[11]。它还是GSH合成的限速前体，可代谢生成牛磺酸和3′-磷酸腺苷-5′-磷酸硫酸盐（PAPS），这些物质参与解毒和物质修饰[12]。Hcy是蛋氨酸代谢的中间产物；在正常生理条件下，它可以重新甲基化生成蛋氨酸或通过转硫途径转化为Cys，参与甲基代谢和基因表达调控[13]。GSH由谷氨酸、Cys和甘氨酸组成的三肽，是细胞中最重要的内源性抗氧化剂[14]。它可以直接清除自由基，作为GSH过氧化物酶的底物还原过氧化氢和脂质过氧化物，再生维生素C和E，并保护蛋白质的巯基免受氧化[15]、[16]。同时，在酶的催化下，GSH可以与毒素（如药物、致癌物和重金属）结合发挥解毒作用，并通过谷胱甘肽化修饰调节细胞信号传导、增殖和免疫功能[17]。这三种硫醇在代谢上紧密相连：蛋氨酸代谢产生Hcy，Hcy通过转硫途径转化为Cys，Cys又是GSH合成的关键原料，GSH则保护相关代谢酶，共同构成了体内的硫醇氧化还原稳态系统[18]、[19]。
异常的Cys水平会通过改变二硫键的形成破坏蛋白质折叠和稳定性，影响必需酶的活性，并限制GSH生物合成的限速底物供应[20]。Cys缺乏或过量都会扰乱氧化还原平衡，破坏硫-氨基酸代谢，进而影响细胞保护和解毒途径，导致生长缓慢、头发变色、肝损伤和皮肤病变等疾病[21]、[22]、[23]、[24]、[25]。Hcy水平升高称为高Hcy血症，会损害供应GSH合成所需Cys的转硫途径，进一步加剧氧化应激[26]。过量的Hcy会引起内皮功能障碍、促进血管炎症、血小板聚集和血栓形成，加速动脉粥样硬化，增加心血管和脑血管疾病的风险。它还具有神经毒性，并通过异常甲基化干扰表观遗传调控[27]、[28]。GSH的缺乏会直接削弱主要的内源性抗氧化防御系统，导致活性氧（ROS）过度积累，蛋白质、脂质和DNA氧化损伤，以及氧化还原敏感酶失活[29]。GSH缺乏还会影响外源物质、药物、致癌物和重金属的解毒，削弱免疫功能，破坏依赖氧化还原的信号传导和谷胱甘肽化，从而促进氧化应激、炎症、细胞凋亡和多种退行性和代谢性疾病的发展[30]、[31]、[32]、[33]、[34]。因此，开发有效可靠的方法来分析和量化生理环境和过程中的生物硫醇对生物科学和生物医学研究具有重要意义[35]、[36]、[37]。
荧光成像技术提供了实时的无创检测、高时空分辨率、多色标记以及高灵敏度和特异性，适用于硫醇等生物分子的研究，显著增强了在活体系统中研究硫醇相关生物学的能力，为临床诊断和治疗提供了宝贵的见解和强大的工具[38]、[39]、[40]、[41]、[42]。过去几十年里，荧光传感领域取得了飞速发展，报道的用于硫醇分子成像的荧光探针数量不断增加[43]、[44]、[45]、[46]、[47]。开发基于活性的硫醇探针的一个主要挑战是解决它们之间结构相似但生理功能不同的选择性问题[48]、[49]、[50]、[51]。了解它们的内在关系和结构特征对于开发特定的荧光探针至关重要。鉴于该领域的快速发展，最近在硫醇荧光传感和成像方面的进展需要进行全面分析和系统总结。
迄今为止，已经发表了大量关于硫醇响应荧光探针的综述。尽管有许多综述总结了用于检测Cys、Hcy和GSH的荧光探针，但仍有一些问题需要解决[52]、[53]。应该提供对反应机制和结构-性能关系的深入分析，而不仅仅是列出分子结构和合成路线。应系统比较不同探针家族的选择性、动力学、光稳定性和定量可靠性，为读者提供合理的探针选择指导。细胞内微环境干扰（pH值、粘度、氧化还原状态）、亚细胞靶向中的脱靶反应、深层组织成像、长期监测和临床兼容性等问题有时被忽略[54]。因此，考虑到该领域的快速发展，有必要系统阐述和总结硫醇荧光探针的设计原理、传感机制和出色的生物应用。
本文将重点关注该领域的最新进展，详细讨论用于检测生物系统中硫醇的小分子荧光探针。我们将系统讨论荧光团、官能团和硫醇传感机制等重要主题。同时，全面回顾和总结相关设计策略、工作原理以及硫醇识别和检测的生物医学应用。这些探针将通过加法、取代、配位和氧化还原反应四种类型进行分类，以突出其中的选择性机制。我们希望本文能帮助读者深入了解该领域，并为开发有前景的硫醇探针提供灵感和策略，同时为化学、环境和生物传感、成像及治疗应用提供技术候选方案（图1）。
部分摘录
代表性荧光团
选择具有适当特性的荧光染料对于开发分子探针至关重要。研究的进步不断带来了具有优异特性的荧光染料的报道，这些染料的吸收和发射光谱覆盖整个可见光区域到近红外区域，从而推动了新型荧光染料的发展[55]、[56]、[57]。本节将总结目前可用的主要荧光染料。
丙烯酸酯官能团
作为关键官能团，丙烯酸酯最早由Yang等人在2011年系统设计并报道[112]。基于丙烯酸酯的探针的响应机制巧妙地结合了生物硫醇的强亲核性和复杂的探针结构，使其成为目前最广泛使用的硫醇探针识别基团之一。作为经典的Michael受体，其α,β-不饱和羰基的碳原子表现出显著的有效区分三种类型硫醇的策略
有效区分三种主要生物硫醇Cys、Hcy和GSH是设计硫醇靶向荧光探针的核心挑战，因为这些硫醇具有相似的化学性质但具有不同的生理作用和病理意义。为应对这一挑战，研究人员开发了一系列复杂的区分策略，每种策略都有独特的反应机制、设计原理和应用场景。光诱导电子转移（PET）
光诱导电子转移（PET）机制在荧光传感器设计中起着关键作用，用于检测质子和金属离子。这一过程的核心在于光激发引发的方向性电子转移：光子吸收后，电子从分子的最高占据分子轨道（HOMO）转移到最低未占据分子轨道（LUMO），生成电子激发态。存在两种典型的电子转移途径活细胞成像
活细胞成像是基于硫醇荧光传感的最流行应用。荧光探针因其优异的细胞膜渗透性能够进入活细胞，并与细胞内的Cys、Hcy和GSH发生特异性识别反应。通过荧光信号的开启、增强或波长变化实现这些硫醇的原位可视化追踪[151]、[152]。该方法实现了实时、动态和非破坏性的监测利用亲核加法反应的荧光探针
1981年，Sippel等人首次报道了基于马来酰亚胺加法反应的硫醇探针[169]。此后，利用这种反应的荧光探针不断涌现，Michael型探针也得到了快速发展。目前，许多探针都利用加法反应进行设计，包括与醛、酮、马来酰亚胺、烃类、Schiff碱和chromenes反应的硫醇探针，这些探针作为高效的Michael受体利用亲核取代反应的荧光探针
亲核取代反应涉及带有负电荷或部分负电荷的亲核试剂攻击带有部分正电荷的亲电中心（通常是带有离去基团的碳原子），从而取代离去基团。引入不同的吸电子基团会扰乱荧光团的固有电子推拉系统，这取决于电子供体和电子受体之间的平衡利用配位反应的荧光探针
某些含有氮、氧或硫配位位的荧光染料可以与金属化合物形成荧光染料-金属复合物[286]。特定分析物可以置换这些金属复合物，导致荧光发射的变化[287]、[288]。基于这一原理，开发了许多针对特定分析物的荧光探针。其中，用于检测硫醇的探针通常使用Cu2+、Hg2+和Ag+等金属进行活化或利用氧化还原反应的荧光探针
生物体内的硫醇可以根据环境条件以氧化形式（-S-S?/-SR）或还原形式（-SH）存在，因此具有有限的氧化还原潜力。因此，开发了许多新型探针。在这些探针中，有些探针能够区分GSH和Cys/Hcy，因为它们具有不同的还原能力。结论
过去十年中，开发了多种响应性的荧光传感器，用于硫醇的特异性检测和成像，这些传感器是一类重要的化学工具，用于识别和解析硫醇的生理和病理作用[337]、[338]、[339]。硫醇广泛的复杂反应性一方面使得设计高选择性和高灵敏度的可激活探针更加困难，但另一方面也使其成为可能利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的竞争性财务利益或个人关系。致谢
本研究得到了国家自然科学基金（编号22179107、22577100、22477100、22171223、22307102和U1903133）、陕西省自然科学基础研究计划（编号2024JC-YBMS-104）、陕西省创新能力支持计划（编号2023-CX-TD-75和2024ZC-KJXX-040）、陕西省技术创新引领计划（编号2023KXJ-209、2024QCY-KXJ-142和2025QCY-KXJ-124）以及陕西省重点研发计划的支持。
