《Developmental & Comparative Immunology》：Distribution, polymorphism, and function of the cellular-aggregation-promoting protein,
Apostichopus japonicus galactose-binding C-type lectin
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日本海月水母的AjGBCL蛋白通过重组表达验证其促进细胞聚集功能，免疫组化发现该蛋白主要存在于基嗜性粒细胞和肠道细胞中，并揭示其mRNA序列存在高度多态性（23种不同cDNA编码）。分隔符：
杉原俊辅（Shunsuke Sugawara）、桑田沙罗（Sara Kuwata）、佐藤美雅比（Miyabi Sato）、稲叶美由（Miyu Inaba）、田口瑞树（Mizuki Taguchi）、筒井茂之（Shigeyuki Tsutsui）、中村修（Osamu Nakamura）
日本神奈川县相模原市南区北里1-15-1，北里大学海洋生物科学学院，邮编252-0373
摘要
棘皮动物的体腔细胞在受到各种刺激时会迅速聚集。在之前的研究中，我们在日本海参（Apostichopus japonicus）中发现了一种内源性促聚集因子，并将其命名为AjGBCL，这是一种能够结合半乳糖的C型凝集素。在本研究中，我们制备了重组AjGBCL（rAjGBCL）以及抗rAjGBCL的小鼠血清。实验结果证实，rAjGBCL确实能够促进体腔细胞的聚集。Western blot检测显示，在非还原条件下，AjGBCL可以以单体、二聚体或四聚体的形式存在。免疫组化结果显示，AjGBCL主要分布在几种体腔细胞类型的颗粒中，这些细胞类型与之前描述的嗜碱性颗粒细胞相对应。肠道中的免疫阳性细胞也表现出类似颗粒细胞的形态，这表明AjGBCL是由多种组织中的驻留体腔细胞产生的。此外，我们还在AjGBCL的mRNA中发现了显著的序列多态性。从5个个体中获得的28个克隆中，我们识别出了23种不同的cDNA序列，这些序列编码了23种不同的氨基酸序列。在144个氨基酸组成的序列中，有40个位置发生了氨基酸替换。本文讨论了这种显著多态性的可能起源及其意义。
引言
棘皮动物拥有一个充满体腔液的大型体腔，其中含有多种类型的体腔细胞。当棘皮动物受到损伤或体腔液从体内被排出时，这种液体通常不会凝固（Boolootian和Giese，1959年）。相反，体腔细胞会迅速聚集。
这种现象被称为细胞聚集，被认为是棘皮动物先天免疫的主要效应反应，有助于伤口封闭以及入侵微生物或异物的包裹。细胞聚集现象最早在一个多世纪前就被描述过（Geddes，1880年）。尽管后续研究对此进行了记录，但其分子机制仍大部分未知。目前仅有少数内源性分子被认为与棘皮动物的细胞聚集有关。例如，Amassin这种嗅觉相关蛋白能够增强紫海胆（Strongylocentrotus purpuratus）中体腔细胞的交联作用（Hillier和Vacquier，2003年）；绿海胆（Lytechinus variegatus）体腔细胞中的芳基硫酸酶参与细胞间的黏附（D’Andrea-Winslow等人，2012年）。然而，这些蛋白质被认为主要是增强现有的细胞黏附作用，而不是直接引发聚集。
在之前的研究中，我们发现肠道组织及其提取物能够显著加速日本海参（Apostichopus japonicus）中体腔细胞的聚集（Taguchi等人，2021年）。这种效应可以被半乳糖强烈抑制，但其他糖类则没有这种作用。我们分离出了具有这种活性的因子，并确定它是一种由158个氨基酸残基组成的半乳糖结合C型凝集素，将其命名为AjGBCL（A. japonicus半乳糖结合C型凝集素）。这是首个被证实能促进棘皮动物体腔细胞聚集的内源性因子。C型凝集素被广泛认为是先天免疫中的模式识别分子，能够介导基于碳水化合物的相互作用。许多可溶性的C型凝集素会形成寡聚结构，并能与其他细胞或微生物发生交联。然而，由于AjGBCL无法诱导经戊二醛固定的体腔细胞聚集，因此其活性不太可能是通过凝集素介导的黏附作用实现的。
为了进一步研究AjGBCL，我们制备了重组AjGBCL（rAjGBCL）并检测了其促聚集活性。随后我们生成了特异性多克隆抗体，并通过免疫组化方法确定了产生AjGBCL的细胞类型，包括体腔细胞和肠道组织。在制备rAjGBCL的过程中，我们意外发现了AjGBCL cDNA序列之间存在显著差异，这促使我们进一步研究了不同组织和个体之间AjGBCL的序列多态性。
研究方法
实验动物
实验用的日本海参（绿色个体）是从商业供应商处购买的，使用人工海水（Sea Life，Marine Tech，日本）饲养在玻璃水族箱中，温度维持在13°C，直至实验使用。采样前，根据Yamana等人（2005年）的方法，使用L-薄荷醇（0.22 g/L海水）对动物进行麻醉。所有实验操作均遵循北里大学的“实验室动物饲养和使用规定”。本研究已获得北里大学的批准。
rAjGBCL的制备
首先使用rAjGBCL-F和rAjGBCL-R引物对扩增的PCR产物进行了测序以确认其序列。然而，如后文所述，我们未能获得与先前报道的AjGBCL序列完全相同的序列。因此，为了制备重组蛋白，我们选择了一个与AjGBCL具有99%同源性的序列（图7中的Int 4-1），在该序列中Val40被Ile40取代，Ser71被Gly71取代。rAjGBCL融合蛋白的预测分子量为……（具体分子量数据缺失）
讨论
在之前的研究中，我们发现AjGBCL是首个被证实能促进A. japonicus体腔细胞聚集的内源性因子。本研究通过研究其重组形式、寡聚状态以及组织定位和序列多样性，进一步扩展了之前的发现。虽然检测到多种形式的天然AjGBCL存在结构异质性，但单体rAjGBCL的促聚集活性表明……（具体内容缺失）
作者贡献声明
田口瑞树（Mizuki Taguchi）：撰写、审稿与编辑、实验设计。筒井茂之（Shigeyuki Tsutsui）：撰写、审稿与编辑、实验实施。杉原俊辅（Shunsuke Sugawara）：实验实施、资金筹集。桑田沙罗（Sara Kuwata）：实验实施。佐藤美雅比（Miyabi Sato）：实验实施。稲叶美由（Miyu Inaba）：实验实施。中村修（Osamu Nakamura）：撰写初稿、监督、项目管理、概念构思
未引用参考文献
Canicattì等人，1989年；Geddes，1879年；Jans等人，1995年；Apostichopus japonicus和Nippon。资助
本研究得到了日本学术振兴会（2020-4058项目）的资助。
