《eBioMedicine》：Nasal RNA-scaffold-protein vaccine protects mice from human H5N1 clade 2.3.4.4b virus lethal infection and safeguards against vaccine-unmatched viruses
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面对H5N1禽流感再次溢出至人群的潜在威胁，以及当前肌注疫苗无法有效诱导黏膜免疫的挑战，研究人员开发了一种名为RNA-支架-蛋白疫苗（RSPVac）的新型非感染性鼻腔疫苗。该研究在小鼠模型中证实，RSPVac可诱导强大的黏膜和全身抗体反应及T细胞应答，不仅完全保护动物免受疫苗匹配的H5N1致死性感染，还对疫苗不匹配的H1N1和H7N9感染展现出显著保护力，并揭示了与蛋白质-RNA复合物形成相关的免疫激活机制。这项工作凸显了RSPVac作为预防人畜共患病毒传播的黏膜疫苗平台的巨大潜力。
流感病毒，尤其是高致病性的禽流感H5N1，就像自然界中一个伺机而动的“潜伏者”。近年来，H5N1病毒分支2.3.4.4b再次从鸟类“跳”到人类身上，虽然病例尚属零星，但其高死亡率依然敲响了公共卫生的警钟。更令人担忧的是，这些病毒的传播常常难以预测，人类免疫系统对其表面蛋白可能毫无“经验”。现有的季节性流感疫苗主要通过肌肉注射接种，它们虽然能在体内激发免疫力，却难以在病毒入侵的“第一道防线”——呼吸道黏膜建立起有效的屏障。这就好比只在“后方”布防，却忽视了“边境口岸”的检查。因此，能够直接在鼻腔和呼吸道诱导强大黏膜免疫的鼻腔疫苗，被视为阻断病毒传播和动物向人类“跳跃”的关键策略。然而，目前针对高致病性禽流感的人类可用疫苗中，鼻腔疫苗极为匮乏。面对这一紧迫需求，来自香港大学的研究团队将他们此前在新冠疫情期间开发的创新型疫苗平台——RNA-支架-蛋白疫苗（RSPVac），转向应对最新的H5N1威胁，并系统评估了其保护效果，相关成果发表在《eBioMedicine》上。
为开展此项研究，作者主要应用了以下几项关键技术：利用哺乳动物细胞表达系统（Expi293F）重组表达流感病毒血凝素（HA）头部与核蛋白（NP）的融合蛋白，并通过体外转录制备特异性非编码单链RNA（R326），两者按特定比例混合形成RSPVac复合物。在动物模型中，对BALB/c小鼠进行两次滴鼻免疫。通过酶联免疫吸附试验（ELISA）、血凝抑制试验（HAI）、聚焦减少中和试验（FRNT）以及细胞内细胞因子染色等多种免疫学方法，全面评估血清和支气管肺泡灌洗液（BALF）中的抗体水平、亚型及T细胞应答。此外，采用微珠多重细胞因子检测和单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术，深入剖析了疫苗接种早期的先天性免疫反应和感染后的免疫细胞图谱。病毒攻击实验则使用高致病性H5N1（包括分支2.3.4.4b）、H1N1和H7N9病毒，通过监测体重、存活率、疾病评分及组织病毒载量来评估疫苗的保护效力。
设计流感特异性RSPVac
研究人员设计了针对H5N1和H1N1的RSPVac，其蛋白成分是将流感病毒的HA头部与高度保守的NP进行融合。RNA成分（R326）则源自病毒基因组的一段非编码序列，它不仅作为免疫刺激剂，更关键的是作为“支架”，促进抗原-NP融合蛋白形成复合物。所有成分均源自病毒，不含人工化学佐剂。
早期鼻腔免疫激活是短暂且受调控的
单次滴鼻接种RSPVac后，小鼠肺部在早期（24小时）出现了强烈的细胞因子表达，但在48小时内迅速回落至基线水平，表明其引发的先天性免疫反应是强烈而短暂的，避免了持续炎症可能造成的组织损伤。单细胞RNA测序进一步揭示，此时肺部募集的中性粒细胞呈现“调节性”和“效应性”两种功能平衡的亚群，这种平衡的免疫环境有利于后续有效免疫应答的建立。
RSPVac针对高致病性H5N1的免疫原性与保护性免疫
小鼠经两次RSPVac滴鼻免疫后，在血清和黏膜（BALF）中均产生了高水平的抗HA和抗NP的特异性抗体，包括IgG和IgA。虽然针对H5N1的中和抗体在小鼠模型中检出率有限（这与该模型特点有关），但疫苗接种成功诱导了黏膜驻留的T细胞活化。攻击实验证明，接种了疫苗匹配株RSPVac（如针对H5N1/1194的疫苗）的小鼠，在经受致死剂量的同源H5N1或H1N1病毒攻击时，获得了完全保护，无体重显著下降或死亡，且肺部和鼻甲中检测不到病毒。
训练有素的免疫景观使接种小鼠能应对不匹配的挑战
更引人注目的是，用针对H5N1的RSPVac免疫的小鼠，在面对疫苗不匹配的H1N1/PR8和H7N9/Anhui/1病毒的致死性攻击时，尽管出现了暂时的体重下降，但最终全部存活并康复。单细胞RNA测序分析发现，在这些免疫小鼠感染不匹配病毒后，其肺部的巨噬细胞抗原提呈相关基因（如MHC-II分子）表达上调，B细胞显示出分泌IgA的迹象，而CD4+T细胞和CD8+T细胞则表现出功能增强和组织归巢相关的基因特征。这表明RSPVac免疫塑造了一个“训练有素”的免疫系统，即使在中和抗体“失灵”时，也能通过增强的先天感知、抗原提呈和细胞免疫应答来协同控制感染。
RSPVac的生物分子特性影响疫苗效力
通过使用RNA结合能力缺陷或缺乏液-液相分离（LLPS）能力的突变NP蛋白制备RSPVac，研究人员发现，这些突变虽然对抗体应答影响不大，但却显著削弱了黏膜T细胞的应答。这提示，蛋白质与RNA形成复合物的生物物理特性，对于激发均衡、有效的黏膜免疫，特别是T细胞免疫，可能起着至关重要的作用。
综上所述，这项研究证实，鼻腔接种RSPVac能够在小鼠模型中诱导强大的全身和黏膜免疫反应，针对高致病性H5N1病毒（包括引起关注的2.3.4.4b分支）提供完全保护。其重要意义在于，RSPVac展现出了令人期待的交叉保护潜力，能够保护动物抵御抗原性不同的疫苗不匹配流感病毒的攻击。这种保护作用可能与疫苗所激发的、针对高度保守NP的细胞免疫以及一个“训练有素”的免疫状态有关。此外，研究初步揭示了蛋白质-RNA复合物形成在激活黏膜免疫中的重要性，为未来黏膜疫苗的设计提供了新的思路。作为一种成分明确、完全源自病毒的非感染性疫苗平台，RSPVac在快速应对新发突发人畜共患传染病方面展现出良好的应用前景。当然，将研究成果推向临床应用，仍需在更多动物模型（如雪貂、非人灵长类）中验证其安全性与有效性，并优化生产工艺和评估免疫持久性。这项工作由香港特别行政区政府创新科技署的Health@InnoHK计划支持，Joy-Yan Lam、Chun-Kit Yuen、Shuk-Kwan Cheung、Pak-Him Cheung、Kwok-Yung Yuen和Kin-Hang Kok共同完成。
