《Environmental Toxicology and Pharmacology》：Activation of the MKK4/7-JNK-c-Jun axis mediates Bisphenol F-induced neurodegeneration and behavioural alteration in adult zebrafish
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神经行为学改变及氧化应激介导的MKK4/7-JNK-c-Jun凋亡通路在BPF成年斑马鱼中的毒性机制研究。摘要：
Suvam Bhoi|Prerana Sarangi|Lilesh Kumar Pradhan|Pradyumna Kumar Sahoo|Bhabani Sankar Sahoo|Saroj Kumar Das
印度奥里萨邦巴拉萨奥雷的Kuntala Kumari Sabat女子学院动物学系，邮编756003
摘要
双酚F（BPF）作为一种工业上替代双酚A（BPA）的物质被广泛使用，但由于其化学稳定性、广泛应用以及在多个生态系统中逐渐被发现，它最近已成为一种全球性的环境污染物。尽管它被认为是一种更安全的替代品，但新的数据表明，BPF可能会产生类似甚至更严重的毒理学后果。本研究发现，暴露于环境相关浓度的BPF的成年斑马鱼表现出明显的焦虑行为、认知能力下降以及对光暗环境的偏好降低，这表明神经行为功能出现了问题。这些行为变化表明，长期接触BPF会破坏神经元回路完整性和情绪调节能力。生化测试显示，总抗氧化能力显著下降，过氧化氢酶和超氧化物歧化酶的活性减弱，同时脂质过氧化水平升高。这些变化表明斑马鱼大脑中存在严重的氧化应激和抗氧化防御机制受损。在分子水平上，观察到MKK4/7-JNK-c-Jun信号通路随时间激活，这与氧化条件下促凋亡MAPK通路的启动一致。组织学评估证实了神经元损失和染色质浓缩，尤其是在对成年动物神经发生至关重要的室管膜周围灰质区域。总体而言，我们的研究结果表明，长期接触BPF会触发氧化应激介导的凋亡信号通路，导致神经退行性和显著的行为缺陷。这项研究强调了重新评估BPF的环境安全性和监管必要性的紧迫性，考虑到其广泛的应用及其对脊椎动物神经健康的潜在危害。
引言
在21世纪，人为产生的有毒物质在维持生命的环境中的比例正在以惊人的速度增加，这些物质对发展威胁生命的健康问题构成了重大风险。其中，塑料及其制品由于需求量大、成本低、耐用且易于消费者获取而扮演着关键角色。随着前所未有的使用和未经保护的处置，塑料作为增塑剂分解并渗入环境已成为不可避免的现象。双酚类是一组合成的酚类有机增塑剂，广泛用于玩具、塑料容器、环氧树脂以及食品和饮料罐头等消费品和工业产品的生产中（Vandenberg等人，2007年）。常见的双酚衍生物包括BPA、BPS、BPF和BPAF。由于聚合物基质中的化学键较弱，双酚类可以轻易渗入食物、饮料和环境中。与塑料材料长期接触以及土壤和水体的污染会导致人类暴露（Huang等人，2012年；Rochester，2013年；Kim等人，2022a年）。双酚类的内分泌干扰特性是其毒理学特性的主要原因。它们通过结合甲状腺、孕酮和雌激素受体来模仿或抵消天然激素，从而改变正常的激素信号传导。根据Rochester（2013年）的研究，这种干扰增加了癌症、代谢紊乱和生殖失败的风险。随着对BPA的监管限制日益严格，工业上开始使用BPA的类似物，尤其是BPF，作为热敏纸、环氧树脂和塑料的替代品（Chen等人，2016年；Andujar等人，2019年）。然而，越来越多的证据表明，一些BPA类似物可能表现出相似甚至更大的毒性潜力。先前的研究表明，BPA及其结构类似物可以在哺乳动物细胞中诱导线粒体功能障碍、氧化应激和细胞凋亡，突显了它们的健康风险（Xu等人，2024年；Huang等人，2024年）。此外，在斑马鱼胚胎中的比较毒理学研究显示，包括BPF在内的BPA类似物可以通过氧化应激相关机制破坏生殖神经内分泌系统（Qiu等人，2021年）。与这些报告一致，我们的发现表明，长期接触BPF会触发氧化应激介导的凋亡信号通路，导致神经退行性和显著的行为缺陷。因此，这项研究强调了重新评估BPF的环境安全性和监管必要性的紧迫性。
介绍
在21世纪，人为产生的有毒物质在环境中的比例正在以惊人的速度增加，这些物质对发展威胁生命的健康问题构成了重大风险。其中，塑料及其制品由于其高需求、低成本、耐用性和易于消费者获取而扮演着关键角色。由于前所未有的使用和未经保护的处置，塑料作为增塑剂分解并渗入环境已成为不可避免的现象。双酚类是一组合成的酚类有机增塑剂，广泛用于玩具、塑料容器、环氧树脂以及食品和饮料罐头等消费品和工业产品的生产中（Vandenberg等人，2007年）。常见的双酚衍生物包括BPA、BPS、BPF和BPAF。由于聚合物基质中的化学键较弱，双酚类可以轻易渗入食物、饮料和环境中。与塑料材料长期接触以及土壤和水体的污染会导致人类暴露（Huang等人，2012年；Rochester，2013年；Kim等人，2022a年）。双酚类的内分泌干扰特性是其毒理学特性的主要原因。它们通过结合甲状腺、孕酮和雌激素受体来模仿或抵消天然激素，从而改变正常的激素信号传导。根据Rochester（2013年）的研究，这种干扰增加了癌症、代谢紊乱和生殖失败的风险。随着对BPA的监管限制日益严格，工业上开始使用BPA的类似物，尤其是BPF，作为热敏纸、环氧树脂和塑料的替代品（Chen等人，2016年；Andujar等人，2019年）。然而，越来越多的证据表明，一些BPA类似物可能表现出相似甚至更大的毒性潜力。先前的研究表明，BPA及其结构类似物可以在哺乳动物细胞中诱导线粒体功能障碍、氧化应激和细胞凋亡，突显了它们的健康风险（Xu等人，2024年；Huang等人，2024年）。此外，在斑马鱼胚胎中的比较毒理学研究显示，包括BPF在内的BPA类似物可以通过氧化应激相关机制破坏生殖神经内分泌系统（Qiu等人，2021年）。与这些报告一致，我们的发现表明，长期接触BPF会触发氧化应激介导的凋亡信号通路，导致神经退行性和显著的行为缺陷。然而，新的数据表明，BPF的毒理学后果与BPA相当，甚至在神经系统中更为严重。
由于BPF的广泛应用，其在环境中的释放和持久性正在增加。BPF污染已在多种介质中被记录到，包括地表水、地下水和工业废水（Lalwani等人，2020年）。作为内部积累和持续人类暴露的证据，BPF也在人类尿液中被发现（Santoro等人，2019年；Gu等人，2020年；Wang等人，2021年）。在这方面，BPF暴露的神经后果不容忽视。早期研究表明，BPF能够穿透血脑屏障，破坏神经元通讯，并引发氧化应激和凋亡过程，所有这些都可能导致神经退行性病变（Kinch等人，2015年）。认知异常、行为障碍、突触可塑性下降和神经元分化改变是已报告的影响之一（Cantua和Mulligan，2025年）。氧化应激的生成是由于活性氧（ROS）过多或抗氧化防御减弱导致的氧化平衡失调，这是BPF诱导的神经毒性的主要机制之一（Zhang等人，2016年）。大脑特别容易受到氧化损伤，这可能导致脂质过氧化、蛋白质氧化和DNA损伤，因为大脑对氧气的需求高且含有大量脂质（Cobley等人，2018年）。由于水生环境是塑料污染的主要来源，包括来自工业和家庭废物的排放、雨水等，水生生态系统模型生物为了解BPF引起的神经后果和天然化合物的有效性评估提供了重要依据。
斑马鱼（Danio rerio）是一种有效的脊椎动物模型，用于研究环境神经毒性，因为它们发育迅速，遗传和生理特征与人类相似，且胚胎透明，可以实时观察大脑过程。人类和斑马鱼的基因组在大约70%的情况下是相似的（Howe等人，2013年）。此外，斑马鱼具有强大的抗氧化防御系统，包括对减少氧化应激至关重要的酶，如谷胱甘肽还原酶（GR）、过氧化物酶、过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）等（Lushchak，2011年；Kalueff等人，2014年；Chowdhury和Saikia，2022年）。斑马鱼被认为是评估BPF神经退行性潜力的理想动物模型，因为它们对环境污染物高度敏感，是模拟水生神经毒性的脊椎动物模型，具有相似的神经行为反应和疾病相关结果。然而，关于BPF引起的神经毒性的机制理解在文献中仍然有限。丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路是与BPF诱导的毒性相关的分子通路之一（Wu等人，2025年）。它对于控制细胞存活、分化和细胞凋亡至关重要。在这个通路中，MAPK激酶4和7（MKK4/7）作为c-Jun N末端激酶（JNK）的上游激活剂，JNK是一种对环境毒素高度敏感的应激激活激酶（Sasaki等人，2001年）。研究表明，暴露于BPF会激活MKK4/7，进而导致JNK磷酸化，使转录因子c-Jun变得活跃。磷酸化的c-Jun通过促进促凋亡基因如FasL和Bim的转录来触发caspase依赖的细胞凋亡、线粒体功能障碍和ROS过量产生（Watson等人，1998年；Herdegen等人，1998年；Putcha等人，2003年）。许多神经退行性疾病的特点是突触丧失和进行性神经退化，这是由于MKK4/7–JNK–c-Jun信号通路的长期激活，破坏了神经元稳态（Johnson和Nakamura，2007年；Wu等人，2025年）。鉴于氧化应激、神经行为变化和成年斑马鱼的细胞凋亡，本研究试图探讨BPF的神经毒性潜力。它还旨在阐明MKK4/7–JNK–c-Jun通路在水源暴露后如何介导BPF引起的神经退行性病变。结果将有助于更准确地评估对环境和人类健康的危害，并提供关于BPF诱导的神经毒性的分子基础的重要见解。
实验部分
化学品和试剂
实验所需的化学品和试剂均从Sigma-Aldrich和SRL购买，除非另有说明。实验动物
本研究中的所有实验均遵循了研究所的伦理指南和方案。5-7个月大的斑马鱼（雄性和雌性比例相等）来自印度奥里萨邦的CIFA，并被放置在50升的维护水族箱中。温度维持在25 ± 2°C，光照-黑暗周期为14:10小时，符合标准斑马鱼护理要求BPF暴露改变了斑马鱼的趋暗行为反应
斑马鱼的自然行为是对黑暗的偏好（趋暗性）。这种天然行为受到BPF暴露的干扰，这在光暗偏好测试中显而易见。长期暴露于BPF会导致神经行为改变，例如进入光照区域的次数（F4,68 = 111.9，p < 0.05）（图1b）、在光照区域停留的时间（F4,68 = 183.4，p < 0.05）（图1c）以及在光照区域移动的距离（F4,68 = 77.32，p < 0.05）（图1d）均有所增加讨论
由于生物降解性差、处置不当和工业需求增加，人为产生的有毒物质在最近几十年里以惊人的速度增加。双酚F（BPF）作为塑料制造中双酚A（BPA）的替代品，现已成为一种普遍存在的环境污染物，对生态系统和人类健康具有潜在的全球影响。近年来，BPF的生产和使用量稳步增加，进一步加剧了这一问题结论
本研究阐明了BPF诱导的神经毒性的机制，揭示了长期暴露于环境相关浓度的BPF会通过氧化应激和MKK4/7-JNK-c-Jun凋亡信号通路的激活破坏神经元稳态。行为、生化、分子和组织病理学变化的结合清楚地表明，BPF削弱了抗氧化防御机制，诱导了促凋亡的MAPK激活，并导致了神经元损伤未引用的参考文献
(Andújar等人，2019年；Mu等人，2022年；Mu等人，2022年；Zhang等人，2020年)资助
作者声明在准备本手稿期间获得了奥里萨邦政府科学技术部（ST-BT-MISC-0035-2025-772/ST）和印度政府科学技术部（DST）（DST/CURIE-PG/2024/65）的财政支持。CRediT作者贡献声明
Bhabani Sankar Sahoo：研究、数据分析、数据管理。Saroj Kumar Das：写作-审稿与编辑、验证、监督、项目管理、资金获取、数据分析、概念化。Suvam Bhoi：写作-审稿与编辑、研究、数据分析。Prerana Sarangi：写作-审稿与编辑、写作-初稿、研究、数据分析。Lilesh Kumar Pradhan：写作-审稿与编辑、研究、数据分析利益冲突声明
作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。无致谢
作者感谢印度奥里萨邦巴拉萨奥雷的Kuntala Kumari Sabat女子学院和Siksha ‘O’ Anusandhan（被认定为大学）提供的基础设施支持。作者还感谢印度孟买的Ritendra Mishra博士对手稿校对的宝贵贡献。声明
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