《Enzyme and Microbial Technology》：Enhancement of recombinant protein expression in
Escherichia coli through fusion with short disordered peptides
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LEA II和LEA K作为新型融合标签显著提升了大肠杆菌中脂酶和硅蛋白的低温表达水平，溶胞表达量分别提高18-21倍和11-18倍，且不影响蛋白功能，为解决难表达蛋白提供了新策略。
吴英汉|艾尚杰|穆罕默德·阿里夫·穆罕默德·贾马利|阿米尔·赛哈伊尔·阿米尔·哈姆扎|池野信也
日本北九州市若松区日比基野2-4，久留米工业大学
摘要
原核表达系统已被广泛用于重组蛋白的生产。然而，某些蛋白质在大规模生产中特别难以表达。提高宿主细胞中目标蛋白表达的一种策略是使用融合标签。两种短无序肽（LEA II和LEA K）源自Polypedilum vanderplanki的第三组晚期胚胎发生丰富蛋白（G3LEA），每个肽包含13个氨基酸残基。本研究的目的是探讨LEA II和LEA K（LEA标签）在低温下提高蛋白表达的潜力，特别关注那些难以表达的蛋白质。为了验证LEA标签作为表达增强剂的有效性，我们使用绿色荧光蛋白（GFP）、来自Bacillus licheniformis的脂肪酶（lip）以及来自Suberites domuncula的硅酸蛋白-α（sil）作为模型蛋白，评估它们与LEA标签融合后的表达增强程度。结果显示，LEA II使lip和sil的表达分别提高了18倍和21倍；LEA K则分别提高了11倍和18倍。值得注意的是，LEA II还提高了脂肪酶和硅酸蛋白的可溶性表达。使用LEA标签是提高大肠杆菌中难以表达蛋白质产量的一个有前景的方法。
引言
通过细菌工业生产蛋白质的技术在过去几十年中不断发展并得到应用。大肠杆菌是最受欢迎的表达平台，广泛用于重组蛋白的生产。原核表达系统以其操作简便、培养成本低和产量高等优点而闻名[1]。然而，目标蛋白在大肠杆菌中表达的缺点包括溶解度低、形成包涵体等，这些仍然是实际应用中的瓶颈[2]。为了克服这些缺点，已经开发了许多方法和生物工具，包括多种表达质粒、工程菌株以及不同的融合标签[3]。目前已发现了20多种融合标签，用于提高重组蛋白的溶解度或促进其纯化。例如麦芽糖结合蛋白（MBP）[4]、硫氧还蛋白（Trx）[5]、小泛素样修饰蛋白（SUMO）[6]和谷胱甘肽-S-转移酶（GST）[7]是著名的溶解度增强剂，而六组氨酸标签是最常用的亲和标签[2]、[3]。
不幸的是，有时需要从目标蛋白中去除标签，因为它们可能干扰目标蛋白的正常结构和功能。例如，MBP是最常用的可溶性增强标签，但由于其相对较大的分子量（>40 kDa），可能会阻碍重组蛋白的活性位点[8]。此外，大型标签的表达可能会对宿主细胞造成代谢负担，因为它们会消耗额外的细胞资源。因此，已经开发了小型肽标签（如S-tag[9]、NT11[10]、NEXT-tag[11]、His-tag），这些标签能够像传统标签一样有效地提高目标蛋白的溶解度，同时最小化代谢负担[3]。
短肽标签可以从蛋白质的功能基序中提取，例如从重复的碳酸酐酶结构域中提取的NT11标签[13]。或者，也可以通过高通量筛选从数据库中寻找合适的标签。例如，Ren Jun等人[14]专注于蛋白质的天然无序区域，并成功筛选出两种能够提高重组蛋白溶解度的肽标签。
然而，不同标签对不同目标蛋白的改善效果可能有所不同，有时甚至会对蛋白质的三级结构产生负面影响。因此，人们持续寻求新的融合标签以满足各种需求。
第三组晚期胚胎发生丰富蛋白（G3LEA）是一类具有伴侣蛋白功能的天然无序蛋白（IDPs）[15]、[16]。G3LEA蛋白缺乏保守的三级结构，但具有保守的11个氨基酸重复序列。之前我们设计了一系列LEA肽（如LEA I、LEA II、LEA E、LEA S和LEA K），这些肽也具有伴侣蛋白功能，能够提高细菌的非生物耐受性[17]、[18]。据报道，LEA肽可以作为分子屏障，在体内稳定蛋白质并防止蛋白质和其他生物分子的聚集[19]。Tang等人还发现，源自IDPs的多肽标签可以在最小程度影响融合蛋白活性的情况下促进其可溶性表达[20]。
在这项研究中，我们利用了LEA肽的抗聚集特性，将它们作为融合伴侣来提高目标蛋白的表达。我们研究了两种类型的LEA肽（LEA标签）：
1) LEA II，预测分子量为1391 Da，等电点（pI）为4.78，疏水性平均值（GRAVY）为-1.323；2) LEA K，预测分子量为1533 Da，等电点（pI）为8.14，疏水性平均值（GRAVY）为-1.862（见表1）。与体积较大的溶解度标签（如MBP、GST、NusA和SUMO）不同，这些标签会显著增加融合蛋白的体积，并可能需要去除。我们提出的基于13个氨基酸的天然无序肽的超紧凑型融合标签预计在提高重组蛋白产量的同时，不会带来太大的代谢负担。在本研究中，我们不仅评估了它们对表达水平的影响，还使用绿色荧光蛋白（GFP）和两种难以表达的蛋白质（脂肪酶和硅酸蛋白）在大肠杆菌中的表达情况，以及它们的可溶性分数和酶活性[21]、[22]。我们还比较了N端和C端融合以及培养温度，并进行了分子动力学（MD）模拟，以了解位置依赖性的行为机制。
目标蛋白和质粒
选择脂肪酶和硅酸蛋白作为难以表达的模型蛋白，以评估LEA标签对大肠杆菌中重组蛋白表达的影响，因为之前的研究表明这些蛋白质的表达水平极低[21]、[22]。来自Bacillus licheniformis IBRL-CHS2的脂肪酶（登录号KU984433）可以催化甘油三酯水解为游离脂肪酸和甘油[23]。来自Suberites domuncula的硅酸蛋白-α（登录号CAI46305.1）可以催化……
不同培养温度下GFP表达的N端和C端融合位置比较
将LEA标签（LEA II和LEA K）分别与GFP在N端和C端融合，分别称为II-GFP、GFP-II、K-GFP和GFP-K，以GFP作为对照（图2、图S2）。如图2（A）、（B）和（C）所示，在37°C诱导培养后，GFP-II、II-GFP和G-K的荧光强度均低于对照；特别是K-GFP的荧光强度远低于对照。GFP-K和K-GFP之间荧光强度的显著差异促使我们进一步研究……
结论
在这项研究中，我们探讨了LEA标签是否可以用作融合标签来提高目标蛋白的表达。结果表明，LEA II和LEA K仅在17°C培养温度下提高了GFP的表达。总体而言，N端融合比C端融合更稳定，但我们观察到在37°C培养条件下，N端融合会导致大量包涵体的形成。这表明LEA标签可能会影响蛋白质的成熟过程。
缩写
G3LEA：第三组晚期胚胎发生丰富蛋白；E. coli：大肠杆菌；MW：分子量；pI：等电点；GRAVY：疏水性平均值；GFP：绿色荧光蛋白；lip：脂肪酶；sil：硅酸蛋白；MD：分子动力学；LB：Luria Bertani培养基；PCR：聚合酶链反应；pNPL：对硝基苯甲酸酯；IPTG：异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷；SDS：十二烷基硫酸钠；PAGE：聚丙烯酰胺凝胶电泳；MD：分子动力学；IBs：包涵体；RMSD：均方根偏差
CRediT作者贡献声明
池野信也：撰写 – 审稿与编辑、撰写 – 原稿撰写、可视化、验证、监督、资源提供、项目管理、方法学设计、实验设计、资金获取、数据分析、概念构思。阿米尔·赛哈伊尔·阿米尔·哈姆扎：撰写 – 审稿与编辑、验证、软件使用、资源提供、方法学设计、实验设计、数据分析。穆罕默德·阿里夫·穆罕默德·贾马利：撰写 – 审稿与编辑、验证、软件使用、资源提供、方法学设计利益冲突声明
作者声明以下可能的财务利益或个人关系可能构成利益冲突：池野信也表示获得了日本学术振兴会的财务支持。如果还有其他作者，他们声明没有已知的可能影响本文研究的财务利益或个人关系。
致谢
本研究部分得到了JSPS KAKENHI资助（项目编号JP22K04844）。我们衷心感谢北海道大学的中岛和纪郎教授提供硅酸蛋白基因，以及马来西亚科学大学的Rashidah Abdul Rahim博士慷慨提供脂肪酶基因。他们的贡献对这项研究的成功至关重要。
