《Enzyme and Microbial Technology》：Enhanced Whole-Cell Biotransformation of Carboxylic Acid Reductase Enzymes via Tandem Expression of Phosphopantetheinyl Transferase
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优化磷酸泛醌转移酶（SFP）基因拷贝数可显著提升羧酸还原酶（CAR）介导的1,4-戊二醇（1,4-PDO）合成效率，并扩展至其他底物，为代谢工程系统设计提供新策略。
崔秀妍|李承勋|李赫元|全宇英|安正玉|高贤基|朴世贤|朴京文|沙希·坎特·巴蒂亚|朱正灿|杨荣勋
韩国首尔建国大学工程学院生物工程系
摘要
羧酸还原酶（CARs）作为一种多功能生物催化剂，具有广泛的底物范围。然而，在许多酶反应中，CARs的活性仍然相对较低。尽管人们已经投入了大量精力对CAR本身进行改造，但对于CAR激活所必需的磷泛硫酰转移酶（Sfp）的影响却关注较少。因此，关于CAR与Sfp的最佳比例以实现高效生物转化的信息仍然有限。为了解决这一问题，我们研究了通过引入CAR介导的1,4-戊二醇（1,4-PDO）生产来增强MSM5586（来自Mycobacterium smegmatis）的CAR活性。我们在Escherichia coli中引入了不同数量的基因，结果发现引入三个基因（SU_MSM5586_3S）的菌株产生的1,4-PDO最多，比单个基因系统高出1.43倍。在删除gabD基因以防止醛类氧化并引入ppk2b基因用于ATP再生后，优化后的菌株SU_M3Sd_p在36小时内产生了60.64 mM的1,4-PDO，转化率提高了1.80倍。此外，串联表达基因也提高了另一种CAR（MabCAR，来自Mycobacterium abscessus）在不同底物（如6-羟基己酸和肉桂酸）下的产量，分别提高了1.84倍和2.41倍。这些发现表明，优化基因的拷贝数是提高CAR介导的生物转化效率的有效策略。
引言
羧酸还原酶（CARs）是一种多结构域酶，能够将羧酸还原为其相应的醛类[1]。来自多种微生物的CARs因其广泛的底物适用性而被广泛研究作为生物催化剂[2],[3]。CARs产生的醛类中间体具有很高的多功能性，可以很容易地被还原为醇类，或者进一步转化为各种有价值的衍生物，如酯类、胺类和酰基化合物[4]。这种多功能性促使研究人员寻找对特定底物类别（包括单羧酸、二羧酸、氨基酸、长链脂肪酸甚至芳香酸）具有最高特异性的CARs[1],[4]。
尽管CARs具有潜力，但其转化效率通常较低，在天然全细胞系统中的转化率仅在20%到50%之间[5]。导致这一限制的因素包括必需辅因子（如ATP和NADPH）的缺乏、醛类的毒性以及疏水性底物的溶解度差[5],[6]。研究人员已经探索了多种策略来应对这些挑战。一种广泛采用的方法是对CARs进行定向突变以改变或提高其底物特异性，如表1所示[1],[7],[8],[9],[10],[11],[12]。另一种策略是实施辅因子再生系统，如表2所示[2],[9],[10],[13],[14],[15]。在这些研究中，通常使用多磷酸激酶（PPK）进行ATP再生，而葡萄糖脱氢酶则用于恢复细胞内的NAD(P)H水平[5]。
所有CARs都需要通过磷泛硫酰转移酶（PPTase）进行激活[16]。其中，来自Bacillus subtilis的Sfp是研究最充分的PPTase，常用于激活不同属的CARs[16],[17]。以4-羟基戊酸（4-HV）为例，这是一种来自木质纤维素生物质的可持续底物，首先由Mycobacterium smegmatis的CAR（MsmCAR）将其还原为4-羟基戊醛（图1）。这一还原过程严格依赖于Sfp，需要ATP和NAD(P)H作为必需的辅因子[16],[17]。随后，中间体4-羟基戊醛进一步被内源性醇脱氢酶（ADHs）还原为1,4-戊二醇（1,4-PDO）。
Sfp介导的CAR激活通常被认为效率很高。然而，这一效果主要基于体外实验结果，其中反应条件经过严格优化以确保完全的催化转化。在利用体内生产的工业微生物过程中，分离系统中的动力学参数并不总能直接应用于复杂的细胞环境。因此，有必要评估在T7启动子驱动的高表达条件下，Sfp的活性是否足够。我们假设大量合成无活性CAR（apo-CAR）可能会导致化学计量不平衡，从而消耗有限的Sfp，限制整体催化效率。在追求高浓度二醇生产时，这一潜在瓶颈可能会更加严重。
在这项研究中，我们旨在通过解决CAR与Sfp之间的潜在系统失衡问题来提高全细胞系统中的二醇产量，而不仅仅是关注CAR本身。我们假设增加基因的剂量可以缓解这种系统性的限制，从而提高CAR介导的全细胞系统的整体效率。
试剂
用于菌株构建的DNA聚合酶、限制性内切酶和DNA连接酶购自Enzynomics（韩国大田）。用于质粒提取的ExprepTM Plasmid SV购自GeneAll（韩国首尔）。
用于培养和全细胞反应的试剂包括：腺苷5'-三磷酸二钠盐水合物（>98%）、β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二钠盐还原形式（>90%）、氢氧化钠（>96.0%）和磷酸二氢钠二水合物（>98.0%）等。
sfp基因串联表达增强CAR介导的1,4-戊二醇生产
为了研究增加基因剂量是否能够提高全细胞催化剂的整体性能，我们构建了含有1-4个基因拷贝的菌株，分别命名为SU_Msm_S、SU_Msm_2S、SU_Msm_3S和SU_Msm_4S（图2a）。所有这些菌株都表达了来自M. smegmatis的CARMSM5586，该酶对4-HV具有高特异性[18]。同时，这些菌株还共表达了来自B. subtilis的Sfp，已知其催化活性在不同CAR中可能存在差异。
结论
本研究表明，通过串联表达基因来调节CAR和Sfp之间的基因剂量比对于最大化二醇产量是有效的。这一策略解决了基于T7启动子的全细胞催化剂中car和基因剂量不平衡的问题，从而可能限制整体生物转化效率。结果清楚地支持了我们的假设，即优化基因剂量可以提高生物转化系统的整体效率。
利益声明
作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
资助
本研究得到了韩国贸易、工业与资源部（MOTIR）资助的技术创新计划（RS-2025-13482968、02219753、00467186、20025698和RS-2025-25413062）的支持。
CRediT作者贡献声明
崔秀妍：撰写——初稿、研究、概念构思。
杨荣勋：撰写——审阅与编辑、监督。
朱正灿：撰写——审阅与编辑。
沙希·坎特·巴蒂亚：撰写——审阅与编辑。
朴京文：数据管理。
朴世贤：数据管理。
高贤基：概念构思。
安正玉：方法学设计。
全宇英：方法学设计。
李赫元：概念构思。
李承勋：可视化分析、研究、正式数据分析。
