《Experimental Eye Research》：Experimental Modeling of Acanthamoeba Keratitis in Mice: Isolation and Cultivation of
Acanthamoeba castellanii
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本研究开发了Acanthamoeba keratitis（AK）小鼠模型，通过接触镜载体感染并验证了培养及PCR检测的有效性，为AK的病理机制和治疗研究提供工具。
孙海珍（Hae-Jin Sohn）| 郑秀玉（Suk-Yul Jung）| 金正贤（Jong-Hyun Kim）
韩国水原市16499，Ajou大学医学院微生物学系及Ajou大学研究生院生物医学科学系
摘要
自由生活的棘阿米巴可导致肉芽肿性阿米巴性脑炎或棘阿米巴角膜炎（AK），这是一种眼部感染。AK在佩戴隐形眼镜的人群中最为常见，其原因包括长期使用隐形眼镜、隐形眼镜受到污染以及角膜受伤。体外研究，尤其是治疗药物的开发，需要通过体内实验来验证。我们采用多种方法建立了AK小鼠模型。将A. castellanii（AK/AJ1；1 × 106细胞）接种到2毫米的隐形眼镜片上，然后植入麻醉状态下的小鼠眼部，并缝合眼睑。感染后（1至14天），通过每日观察发现AK病变在小鼠眼中逐渐发展，PCR检测证实了棘阿米巴DNA的扩增。本研究探讨了有效的培养方法，以确保在AK小鼠模型中进行PCR分析的准确性。在接种后1天、3天、7天和14天，分别从AK小鼠模型中收集眼球样本进行PCR检测。结果显示，在不含营养物质的琼脂培养基中，A. castellanii能够成功培养，并且其菌落与大肠杆菌共同生长；随后通过PYG培养基进一步扩大培养规模。此外，从AK模型中培养出的阿米巴的PCR产物与接种阿米巴的遗传信息高度吻合（匹配度超过99%）。我们认为，这种培养和PCR方法可以有效地验证AK在小鼠模型中的发展情况。
引言
致病性自由生活的棘阿米巴（Acanthamoeba castellanii）常见于多种环境中，包括淡水、空调冷却塔和家庭自来水。此外，棘阿米巴可通过隐形眼镜及镜盒引发棘阿米巴角膜炎（AK）[1]、[2]、[3]。AK的风险因素包括长时间佩戴隐形眼镜、个人卫生习惯差、隐形眼镜受到污染以及接触被棘阿米巴污染的水源。过去二十年来，AK病例数量有所增加，这主要归因于隐形眼镜的广泛使用，超过80%的感染病例与佩戴隐形眼镜有关[4]、[5]、[6]、[7]。然而，角膜损伤、眼部手术或接触受污染的水源也可能使非隐形眼镜佩戴者罹患AK[8]、[9]、[10]、[11]。
阿米巴会侵入角膜基质和上皮细胞，引发渐进性炎症及免疫细胞浸润。症状通常逐渐出现并逐渐加重，包括剧烈眼痛、眼睛发红、视力模糊和畏光。由于这些症状与细菌性、病毒性和真菌性角膜炎相似，AK常常被误诊，从而延误了适当的治疗，可能导致不可逆的视力丧失[2]、[12]、[13]。未经治疗的慢性AK可能引发并发症，如角膜瘢痕形成、视力障碍甚至永久性失明。因此，早期诊断和及时治疗至关重要[10]、[14]、[15]。
由于AK的临床表现与其他类型的角膜炎相似，诊断较为困难。确诊需要结合临床观察和实验室检测。患者病史（包括隐形眼镜使用情况）以及眼科检查对于识别角膜异常非常重要[16]、[17]。显微镜检查和培养是直接检测角膜刮片中的阿米巴的最可靠方法。此外，还采用免疫荧光检测、眼部超声和PCR检测等诊断手段[12]、[18]。最近的研究[19]强调了通过物种丰富度和香农多样性指数（Shannon Diversity Index）分析微生物多样性的重要性，以更全面地了解角膜环境。这些先进的诊断方法有助于早期发现和管理多重微生物感染，而传统培养技术往往无法检测到这些感染，从而减少了需要进行角膜移植等侵入性手术的需求。
AK的治疗具有挑战性，因为棘阿米巴的包囊期和滋养体期都对多种治疗方法具有抗性。目前的治疗策略通常包括使用多聚六亚甲基胍（polyhexamethylene biguanide）、氯己定（chlorhexidine）、戊胺嘧啶（pentamidine）和米替福辛（miltefosine）等抗阿米巴药物，同时结合抗真菌治疗或支持性治疗[20]、[21]、[22]。在严重或慢性病例中，可能需要采取角膜移植等手术干预[23]、[24]、[25]、[26]、[27]。最新研究表明，针对棘阿米巴细胞膜的肽类治疗和光动力疗法可能与传统药物治疗联合使用，提供额外的治疗选择[28]、[29]、[30]。
动物模型对于评估治疗药物和了解AK的发病机制至关重要。以往的研究中使用了兔子、大鼠和仓鼠等多种实验动物[31]、[32]、[33]、[34]。在本研究中，我们旨在使用基因型标准化的BALB/c小鼠建立体内AK模型，以确保实验的可重复性。小鼠成功接种了A. castellanii，并通过培养方法和从眼部样本中提取的18S rRNA基因的PCR扩增确认了感染。该AK小鼠模型有助于开展免疫病理学、分子生物学研究以及新治疗方法和预防策略的开发。
材料
废弃的隐形眼镜由Ajou大学医学中心的眼科诊所提供，并在无菌实验室条件下进行处理。随后，我们对隐形眼镜进行擦拭，并将其接种到不含营养物质的琼脂平板上培养。培养两天后，观察到囊状阿米巴并将其分离到无菌细胞培养基中。经鉴定，该阿米巴为A. castellanii（从Ajou大学医学中心的一位AK患者身上临床分离得到，命名为AK/AJ1）。
从AK患者处采集临床样本
为了识别AK患者，我们刮取了隐形眼镜样本，并将其接种到经过热处理的涂有大肠杆菌（E. coli）的不含营养物质（NN）琼脂平板上。NN平板在25°C下培养，并每天用光学显微镜监测棘阿米巴的生长情况。培养3天后，平板上出现了具有刺状伪足的各种形态的滋养体及大量双壁多边形囊泡（图2A）。生长出的囊泡被转移到新的平板上继续培养。
讨论
棘阿米巴角膜炎是一种由棘阿米巴属引起的罕见且严重的眼部感染。美国每年报告约1500例AK病例，其中90%的感染者为隐形眼镜佩戴者[37]、[38]。AK的症状包括剧烈眼痛、眼睛发红和视力模糊。患者还可能出现对光敏感和眼睑肿胀等症状。如果不及时治疗，这些症状会逐渐加重，可能导致
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不适用。作者贡献声明
郑秀玉（Suk-Yul Jung）：研究工作、数据分析、概念构思。金正贤（Jong-Hyun Kim）：撰写 – 审稿与编辑、监督、资源协调、概念构思。孙海珍（HAE-JIN SOHN）：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、资源准备、方法设计、研究实施、资金申请、数据分析、概念构思
数据可用性
本研究生成或分析的所有数据均包含在本文中。
利益冲突
作者声明不存在任何可能影响本文研究的利益冲突。
资助
本研究得到了韩国国家研究基金会（National Research Foundation of Korea，简称NRF）的资助，该基金会由韩国政府科学技术信息通信部（Ministry of Science and ICT）资助，项目编号为NRF-2021R1C1C2009518。
利益冲突声明
? 作者声明不存在可能影响本文研究的已知财务利益或个人关系。
