酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中斯蒂维醇-13-O-葡萄糖苷（steviol-13-O-glucoside）的重新生物合成

《Food Bioscience》：De novo biosynthesis of steviol-13- O-glucoside in Saccharomyces cerevisiae

通过系统工程策略增强MVA途径、半理性改造UGT85C2、敲除竞争性水解酶并优化内质网微环境，成功构建高效产13-表没药糖苷的酵母菌株，5L发酵罐中达到1.3g/L产量，为天然甜味剂绿色生产奠定基础。

　　

罗双双|李珊|邓汉宁|刘世科|何倩|曾伟珠|周敬文

中国江南大学生物技术学院食品合成生物学教育部工程研究中心，中国江苏省无锡市梨湖路1800号，214122

摘要

斯蒂维醇-13-O-葡萄糖苷（13-SMG）是控制斯蒂维醇苷生物合成的关键二萜前体，目前其生产面临瓶颈：MVA途径的前体供应不足、天然糖基转移酶UGT85C2的催化效率低、内源性糖苷水解酶的降解作用，以及由于内质网（ER）微环境不适宜导致P450酶的功能表达受限。本研究通过系统性的工程策略，在酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中实现了13-SMG的从头生物合成，包括增强MVA途径、半理性改造UGT85C2、抑制竞争性水解酶以及优化内质网微环境。这些策略构建了一种高效生产13-SMG的酿酒酵母菌株，在5升生物反应器中发酵产率达到了1.3克/升，为绿色、可持续的工业规模生产高价值天然甜味剂奠定了基础。

引言

联合国粮食及农业组织报告称，到2028年全球糖需求预计将稳步增长至2.03亿吨，十年间增加了3200万吨（Mu?oz-Labrador等人，2024年）。长期摄入高糖饮食与糖尿病、心血管疾病和口腔健康问题有关（Bilal等人，2022年；Mora & Dando，2021年）。同时，健康意识的提高推动了消费者对低热量和更安全糖替代品（如天然甜味剂）的需求。天然存在的强甜化合物是由多种植物和微生物产生的次级代谢产物（Nicholas Chua等人，2023年；Saraiva等人，2020年）。天然甜味剂作为环保、健康意识强且低热量的蔗糖替代品受到了广泛关注。由于绿色、低碳和可持续发展的趋势，对天然甜味剂的需求持续增加（Fan等人，2025年）。斯蒂维醇苷（SGs）在工业规模稳定生产天然甜味剂方面具有显著优势，并具有潜在的健康益处（Ceunen & Geuns，2013年）。

SGs是二萜苷元斯蒂维醇的糖基化衍生物，其区别在于连接到斯蒂维醇骨架上的糖基的数量和位置，特别是在C₁₃-羟基和C₁₉-羧基处。例如，斯蒂维醇-13-O-葡萄糖苷（13-SMG）在C₁₃位置连接了一个葡萄糖分子（Zhou等人，2021年）。由于从植物中提取SGs受到土地、气候和周期的影响（供应不稳定），目前的方法主要集中在化学提取和纯化斯蒂维醇苷和瑞博糖苷A（Reb A）以获得高纯度的甜味剂（Ameer等人，2022年；Bursa? Kova?evi?等人，2018年）。目标斯蒂维亚化合物（如Reb M，最佳甜度）与其类似物浓度较低，因此纯化困难（回收率低、溶剂污染）。Reb M含量低（0.4%–0.5%）及其较差的纯化性能促使人们研究替代生产方法，如全细胞催化和微生物合成（Li等人，2024年；Liu等人，2022年）。为了解决这些阻碍高效和可持续SG生物合成的瓶颈，进一步研究13-SMG至关重要。目前尚未有关于微生物从头合成13-SMG的报道，且微生物SG的产率仍然较低（Y. Xu等人，2022年）。作为底盘生物，酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）具有完整的真核蛋白质表达系统，支持复杂真核酶（如细胞色素P450单加氧酶和糖基转移酶）的正确折叠、翻译后修饰和活性维持（Okonkwo等人，2024年）。这对于高效合成萜类化合物和糖苷衍生物至关重要，使S. cerevisiae成为合成13-SMG的首选宿主（Liu等人，2025年）。

目前，全细胞催化和酶促转化是微生物合成SGs的主要方法。Wang等人构建了一种大肠杆菌菌株用于从头合成Reb A，从而验证了异源微生物合成SGs的可行性（Wang等人，2016年）。与原核生物相比，S. cerevisiae是表达植物来源P450s的更优底盘生物，这一点通过该宿主成功合成Reb D和Reb M得到了证明（Liu等人，2021年）。尿苷二磷酸（UDP）依赖的糖基转移酶UGT76G1具有相对非特异性，经过工程改造后增强了Reb D/Reb M的积累并减少了副产物的产生（Olsson等人，2016年；Shoji等人，2025年）。通过产物运输工程、代谢平衡调节和蛋白质工程，优化了S. cerevisiae在从头合成茶氨酸和Reb M方面的性能（Y. Xu等人，2022年）。通过整合三种策略——敲除内源性糖苷水解酶、增强糖基化能力和延长酶促反应过程，实现了从斯蒂维醇高效全细胞合成Reb M（Li等人，2024年）。因此，提高13-SMG积累和推进微生物合成SGs工业应用的关键策略包括酶工程（例如，理性设计、定向进化）以优化糖基转移酶的催化效率，以及通过优化细胞色素P450羟化酶和还原酶的共表达来重建宿主代谢网络，从而增加前体供应。

本研究通过异源表达优化的Gibberella fujikuroi香叶烯合成酶（GfKS）和细胞色素P450系统CYP714A2-(GGGGS)₃-细胞色素P450还原酶（CPR），实现了斯蒂维醇的从头合成。系统的代谢工程策略增强了S. cerevisiae中的甲瓦酮（MVA）途径，提供了足够的GGPP前体，然后通过糖基转移酶UGT85C2的催化作用将其转化为13-SMG。在此基础上，对糖基转移酶UGT85C2进行半理性改造，并协同增强宿主内质网（ER）的能力并敲除糖苷水解酶，使得工程酵母在摇瓶中的13-SMG产率达到235.8毫克/升（图1）。最后，在5升生物反应器中进行放大发酵，获得了最高报道的1.3克/升产率。该方法建立了一个可靠的上下游平台，支持两种高价值下游衍生物Reb M和Reb D的高效制备。

试剂和基因

角鲨烯、ent-香叶烯酸（ent-KA）、斯蒂维醇和13-SMG标准品购自中国宝鸡Herbest Bio-Tech有限公司。高保真DNA聚合酶Phanta Max Master Mix购自中国南京Vazyme Biotech有限公司。鲑鱼精子DNA（10毫克/毫升）购自中国北京Solarbio科技有限公司。所有其他化学试剂均购自中国上海Sangon Biotech有限公司。

在S. cerevisiae中构建ent-KA和斯蒂维醇生物合成途径

S. cerevisiae的内源代谢网络缺乏SG修饰酶系统（Ceunen & Geuns，2013年）。将Stevia rebaudiana中的关键酶SrCPS（钴焦磷酸合成酶）、SrKS（香叶烯合成酶）和SrKO（香叶烯氧化酶）引入S. cerevisiae细胞中，得到了SS01菌株（图2A），但未检测到斯蒂维醇的积累（图2B）。为了实现ent-KA的异源合成，用GfKS替换了传统的SrCPS和SrKS组合。

讨论

使用S. cerevisiae作为SGs生物合成的细胞工厂已成为合成生物学研究的热点（Mora & Dando，2021年）。S. cerevisiae具有完整的真核蛋白质表达系统和强大的异源途径整合能力，特别适合构建多酶催化的人工生物合成途径（Liu等人，2025年）。然而，13-SMG的从头生物合成仍然具有挑战性。

CRediT作者贡献声明

李珊：撰写 – 审稿与编辑、监督、软件、方法学。邓汉宁：撰写 – 审稿与编辑、方法学。罗双双：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、可视化、验证、实验设计、数据分析。刘世科：撰写 – 审稿与编辑、方法学。何倩：软件、资源管理、数据分析。曾伟珠：撰写 – 审稿与编辑、监督、数据分析。周敬文：项目管理、方法学。

未引用参考文献

Sun等人，2022年；Xu等人，2022年。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的竞争性财务利益或个人关系。

致谢

本工作得到了中国国家重点研发计划（2024YFF1106400）的财政支持。