用于检测新烟碱类农药残留的交联时间分辨荧光免疫层析试纸：竞争原理、快速、可靠且环保的预处理方法

《Food Research International》：Cross-linked time-resolved fluorescence immunochromatographic strip for the detection of neonicotinoid pesticide residues: Competitive principle, rapid, reliable and environmentally friendly pretreatment

本研究开发了一种基于时间分辨荧光免疫层析法的交叉连接式侧流试纸（CTRFLIS），优化荧光探头的合成参数，采用聚合物和表面活性剂的协同效应，建立了无需有机溶剂的绿色预处理系统，在油菜和茴香基质中实现了高灵敏度检测，IMI、THI和CLO的线性范围分别为3-600 ng/mL、5-300 ng/mL、1-700 ng/mL，LOD分别为0.32、0.78、0.13 ng/mL。

　　

李培森|李东翰|王海芳|孙家帅|耿凌军|黄静成|李正涛|Nortoji A. Khujamshukurov|郭亚敏|孙霞|杜芳玲

山东工业大学农业工程与食品科学学院，中国山东省淄博市新村镇西路266号，255049

摘要

本研究聚焦三种典型的新烟碱类杀虫剂：吡虫啉（IMI）、噻虫嗪（THI）和噻虫胺（CLO）。基于时间分辨荧光免疫层析技术，开发了一种交联的时间分辨荧光侧向免疫层析试纸（CTRFLIS）。通过系统优化荧光探针制备的关键参数，并研究聚合物类型、表面活性剂类型和pH值对样品预处理的影响，开发出一种基于聚合物和表面活性剂协同作用的绿色预处理体系，显著提高了检测灵敏度和特异性。采用单因素变量控制方法，确定了这些新烟碱类杀虫剂在中国白菜和细香葱中的最佳提取条件，实现了无需使用有机溶剂的高效提取。本研究制备的CTRFLIS在中国白菜中的线性检测范围分别为：吡虫啉3–600 ng/mL、噻虫嗪5–300 ng/mL、噻虫胺1–700 ng/mL，检测限（LOD）分别为0.32 ng/mL、0.78 ng/mL和0.13 ng/mL；在细香葱中，线性检测范围分别为：吡虫啉3–400 ng/mL、噻虫嗪5–300 ng/mL、噻虫胺5–400 ng/mL，相应的检测限分别为0.28 ng/mL、0.83 ng/mL和0.55 ng/mL。该工作为构建快速、灵敏且低成本的检测平台提供了有效方法。

引言

随着现代农业生产的快速发展，为了确保蔬菜的产量和质量以及防治病虫害，化学药剂的使用量大幅增加（Sun等，2024；Tudi等，2021）。作为新型杀虫剂，新烟碱类农药在全球范围内得到广泛应用。新烟碱类农药的分子结构与尼古丁相似，因此具有优异的杀虫活性和相对较低的毒性（Alsafran等，2022；Satheeshkumar等，2026）。新烟碱类农药中的活性分子（如氯吡啶和带负电荷的药效团）对乙酰胆碱受体具有高度选择性，通过竞争性抑制乙酰胆碱的神经传递功能，最终导致目标昆虫神经麻痹和死亡（Cui等，2023；Matsuda等，2020）。与其他类型的杀虫剂相比，新烟碱类农药的独特优势在于它们可以通过种子包衣或土壤施用被植物根系吸收，有效防止昆虫刺穿和啃食植物（Zhao & Li，2018）。此外，新烟碱类农药提高了害虫控制的效率，例如对蚜虫和白粉虱的防治效果可达90%，并在宠物驱虫和兽医寄生虫控制方面显示出潜力（Addy-Orduna等，2025；Liu等，2025）。然而，新烟碱类农药的广泛使用也带来了问题，研究表明它们可能导致昆虫产生抗性，降低其防治效果。由于新烟碱类农药可被植物根系吸收并扩散到叶片和果实等几乎所有部位，清洗或去皮无法去除残留物，其摄入可能对人类健康构成潜在风险（Ji等，2025；Zhang等，2018）。在农业土壤中，由于新烟碱类农药的强迁移能力及其向深层土壤或地下水的渗透倾向，其残留量显著增加（He等，2024）。因此，加强对食品中新烟碱类农药的监测和检测具有重要意义。

作为即时检测（POCT）的关键工具，免疫荧光试纸在农药残留检测中显示出巨大应用潜力（Z. Li等，2025）。值得注意的是，抗体消耗和样品预处理方法是影响免疫层析试纸研发成本和灵敏度的关键因素。目前，已经提出了一种有效解决方案来应对免疫荧光试纸制备过程中抗体使用带来的高成本问题（D. Li等，2024）。通过采用二次抗体标记策略并引入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐（EDC）作为交联剂，成功制备了用于检测吡虫啉（ACE）的荧光探针，该方法将每次检测的抗体消耗量减少了50%，同时显著提高了检测灵敏度。在以往的研究中，研究人员主要采用依赖复杂程序或有害化学物质的统一样品预处理方法，过度依赖有机溶剂进行农药提取（G. Li等，2023；Zhai等，2024），这不仅增加了操作复杂性，还造成了环境影响。样品预处理方法直接决定了免疫层析试纸的灵敏度、准确性和用户友好性（A. Li等，2021）。有效的预处理方案能够确保分析准确性，同时简化操作流程并降低成本（W.-K. Li & Shi，2020；Yu等，2021）。因此，设计一种简单、高效且环保的预处理方法，以最大化检测性能并避免使用有害有机溶剂，已成为免疫层析试纸优化中的紧迫挑战。

基于可交联的方向性结合抗体荧光探针的构建方法，开发了一种用于检测三种新烟碱类农药（吡虫啉（IMI）、噻虫嗪（THI）和噻虫胺（CLO）的交联时间分辨荧光侧向免疫层析试纸（CTRFLIS）。为了提高CTRFLIS的灵敏度和检测性能，优化了构建过程中的缓冲液pH值和抗体用量等关键实验条件，以确保对不同农药残留物的最佳检测效果。以中国白菜和细香葱为目标基质，本研究重点探讨了在缓冲液中添加表面活性剂和聚合物的方法，以开发一种环保的样品预处理方案，作为传统有机溶剂提取方法的替代方案。传统的样品预处理通常依赖甲醇和丙酮等有机溶剂，虽然能有效提取目标分析物，但可能对环境和操作人员健康造成风险，从而限制了其应用范围。为此，本研究开发了一种环保且同样高效的替代方法。结果表明，所开发的环保预处理方案具有与传统有机溶剂相当的提取效率，操作性和提取性能优异。所提出的绿色预处理策略为免疫层析试纸的优化和更广泛应用提供了新的技术方法和实践基础，具有显著的环境和经济效益。

试剂和设备

所有涉及的试剂和设备在补充材料中有详细描述。

荧光探针的制备

按照Li等（D. Li等，2024）描述的程序，合成了吡虫啉（IMI）、噻虫嗪（THI）和噻虫胺（CLO）荧光探针。取100 μL时间分辨荧光微球（TRFM，1 mg/mL）样品，用磷酸盐缓冲液（PBS；pH 7.0，0.006 M）洗涤两次，该缓冲液通过将0.072 g KH₂PO₄、0.06 g KCl、2.7 g NaCl和1.086 g Na₂HPO₄溶解在1000 mL超纯水中制备而成。

荧光探针的TEM表征

为了验证荧光探针的成功制备，使用透射电子显微镜（TEM）进行了表征。如图2A所示，时间分辨荧光微球（TRFMs）呈现出均匀的球形形态。利用ImageJ软件进行的粒径分析显示平均粒径约为272 nm。图2B-D分别展示了三种新烟碱类农药IMI、THI和CLO的中间产物。

结论

本研究建立了在中国白菜和细香葱基质中使用交联免疫层析试纸检测吡虫啉（IMI）、噻虫嗪（THI）和噻虫胺（CLO）的方法。首先，通过荧光光谱和TEM分析合成了荧光探针并进行了表征。加入GaMIgG和单克隆抗体后，荧光信号减弱，微球粒径增大，这些表征现象证实了探针的成功合成。

CRediT作者贡献声明

李培森：撰写——原始稿件、方法学、实验研究、数据分析、概念构思。李东翰：撰写——原始稿件、方法学、实验研究、数据分析、概念构思。王海芳：撰写——审稿与编辑。孙家帅：撰写——审稿与编辑、数据可视化、实验研究。耿凌军：撰写——审稿与编辑、数据分析。黄静成：数据可视化、软件应用、数据分析。李正涛：撰写——审稿与编辑、数据分析。

利益冲突声明

作者声明不存在可能影响本文研究的已知财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了国家重点研发计划（项目编号：2025YFE0119300）、国家自然科学基金（项目编号：32372438）、山东省重点研发项目（项目编号：2023TZXD057、2024TSGC0318、2024CXGC010918）、山东省自然科学基金（项目编号：ZR2023MC088）的支持。