《Forensic Science International: Genetics》：Separating Sperm from Cell Mixtures by Using a Bubble-Based Acoustofluidic Filtration Device for Forensic DNA Analysis
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气泡声流过滤装置（BAF）可有效分离混合样本中的精子，提升STR分型性别鉴定准确性。实验对比32例双人（1男1女）及33例三人（2男1女）样本，结果显示BAF处理使Y染色体峰值比例提高90.6%和87.9%，男性贡献者特异性STR峰值比例分别达96.9%和97.0%，性别鉴定准确率从93.8%和84.8%提升至100%。该技术通过气泡声流物理分离，避免细胞破裂，显著改善低浓度精子样本的检测效率。
萧琳华|宛婷瑜|苏志文|李翠婷|曾丽瑜|卢彦文|李俊一
台湾国立大学医学院法医学系及研究生院，台北市仁爱路1号1段
摘要
在性侵犯案件调查中，对含有罪犯精液的受害者口腔或阴道拭子进行法医DNA分析至关重要。本研究评估了一种基于气泡的声流过滤（BAF）装置在分离精液与口腔或阴道上皮细胞混合物中的效果，以提高后续男性DNA贡献者的分析准确性。从32个两人样本（1名男性和1名女性）和33个三人样本（2名男性和1名女性）中分离出了精液。对BAF处理前后的样本进行了常染色体和Amelogenin短串联重复序列的基因分型。计算了BAF处理前后Amelogenin Y-to-X等位基因峰高比值以及男性贡献者特异性等位基因峰高的平均比例。使用EuroForMix软件对男性贡献者进行了鉴定。BAF处理后，两人样本中90.6%（29/32）和三人样本中87.9%（29/32）的样本中男性贡献者的等位基因峰高比值增加；男性贡献者特异性等位基因峰高的平均比例分别增加了96.9%（31/32）和97.0%（32/33）。BAF处理后，两人样本中男性贡献者的鉴定准确率从93.8%（30/32）提高到100%，三人样本中从84.8%（28/33）提高到100%。这些结果表明，BAF能够有效分离精液与精液/上皮细胞混合物，并显著提高男性DNA贡献者的鉴定准确性。
引言
在性侵犯案件调查中，通常会收集阴道、口腔和肛门拭子作为法医证据。这些拭子中通常含有混合的细胞群，其中受害者的阴道、口腔或肛门上皮细胞占主导地位，而罪犯的精液细胞仅占少量。例如，使用性侵犯检测工具收集的典型样本（半根棉签）可能只含有几百个精液细胞，女性与男性细胞的比例在10:1到50:1之间[1]。为了从混合样本中鉴定出罪犯的DNA，法医实验室最常用的是常染色体短串联重复序列（STR）位点的基因分型，在某些情况下还会进行Y-STR单倍型分析。尽管这些方法非常敏感，但在高度不平衡的DNA混合物中解读少量男性成分的STR谱型仍然具有挑战性[2]。此外，通过DNA分析鉴定罪犯时，其他贡献者共享的等位基因、掩盖真实等位基因的干扰以及这些不平衡混合物中男性DNA量少导致的等位基因丢失可能会影响鉴定结果[2]。在这些样本中，罪犯的DNA通常以少量存在，最容易从性侵犯检测工具收集的精液细胞中获得，因此需要一种有效的方法来分离精液细胞与其他细胞。这种分离有助于从混合样本中获得最具信息量和可解释性的罪犯DNA谱型[1],[3]。
在传统的差异提取方法中，必须进行多次离心和洗涤步骤才能获得精液沉淀物。这些过程耗时较长（约4-8小时），劳动强度大，并且对技术要求较高[4]。优先裂解方法通过使用DNase选择性地裂解女性上皮细胞并去除女性DNA；然而，当精液与上皮细胞的比例较低时，这种方法往往无法产生清晰的男性STR谱型[5]。另一种方法是荧光激活细胞分选，但在精液细胞数量较少时，其富集效率有限[6]。此外，磁激活细胞分选需要复杂的抗体制备和处理，如果精液细胞失去了目标结构，针对局部精液细胞的抗体可能无效[1],[5],[6],[7]。
微流控技术已成为分离各种类型颗粒（包括细胞）的有效方法。已经开发了几种具有不同细胞操作机制的微流控方法，用于多种细胞分选应用[1],[3],[4],[8]。然而，污染仍然是这些方法的主要限制。上皮细胞和碎片会沉积形成多层结构，将精液细胞困在压缩的“蛋糕”中，从而降低分离效率。此外，由于上皮细胞的独特形态，它们容易附着在表面上，在基于过滤的分离过程中容易堵塞。这种污染行为限制了分离效率，促使人们开发出能够精确控制流场和局部流体动力力的微流控装置，以减少细胞堆积并提高分离性能。其中一种基于气泡的声流过滤（BAF）装置将交叉流过滤（CFF）与声流技术结合在一起，根据精液头部（4–6 μm）和上皮细胞（40–60 μm）的大小差异，将精液细胞从阴道或口腔上皮细胞中分离出来[3],[9]。这种基于CFF的微流控方法在过滤膜表面产生切向剪切流，从而促进高效的细胞分选。该装置利用体积声波诱导气泡振荡，在流经CFF微通道的流体中产生声流。这种声流产生流体动力力和扰动，使聚集的细胞向侧面移动，使堆叠的细胞重新进入流体流中，并在0.5秒内清除污染[9]。该装置用户友好且效率高。样本制备只需约10分钟（包括添加缓冲液和手动混合），细胞分离过程大约需要45分钟[3],[9]。
直接分离不同类型的细胞（如精液细胞和上皮细胞）的方法或仪器将有助于改进样本处理，在法医工作中具有很高的价值。BAF装置采用简单的物理分离技术，避免了细胞裂解，并在分离精液细胞时防止了扩增抑制。在本研究中，我们使用了新开发的非商用BAF装置[9]来分离精液与口腔和阴道上皮细胞的混合物。我们评估了该装置的富集能力及其在准确鉴定男性贡献者方面的性能。
样本制备
样本制备
这项前瞻性研究获得了研究医院的机构审查委员会批准（批准编号：202012222 RIND），并遵循赫尔辛基宣言进行。所有九名明显健康的参与者均签署了书面知情同意书。精液样本来自四名男性贡献者（M1、M2、M3和M4），使用无菌塑料容器（60毫升聚丙烯容器；Deltalab，巴塞罗那，西班牙）收集。
结果
共有65个模拟混合样本（32个两人样本和33个三人样本）使用BAF装置进行了处理。所有样本均进行了分析，没有因分离不当或不完整而被排除。两人样本的DNA浓度在BAF处理前为1.27至10.08 ng/μL，处理后为0.74至6.3 ng/μL。三人样本的DNA浓度在BAF处理前为4.52至18.24 ng/μL。
讨论
我们的结果表明，BAF装置在分离精液与阴道或口腔上皮细胞混合物中的精液细胞方面非常有效。由于BAF装置结合了微气泡和声波，它可以将额外的精液细胞和碎片DNA从细胞碎片和“蛋糕”中释放到BAF处理后的输出中[17]。从这些混合物中富集精液细胞有助于提高男性贡献者的STR谱型分析，从而提高男性贡献者的鉴定准确性。
结论
我们的结果表明，BAF装置是法医工作中分离精液与阴道或口腔上皮细胞混合物中精液的有效工具。如BAF处理前后的STR谱型分析结果所示，该装置提高了大多数样本中Amelogenin Y-to-X等位基因峰高比值和男性贡献者特异性常染色体STR等位基因峰高的平均比例，改善了所有一人一女和两男一女混合物中男性贡献者的鉴定。
伦理批准
这项前瞻性研究获得了研究医院的机构审查委员会批准（批准编号：202012222 RIND），并遵循赫尔辛基宣言进行。
作者贡献声明
宛婷瑜：研究工作。
李翠婷：方法学研究。
苏志文：研究工作。
卢彦文：方法学研究。
曾丽瑜：研究工作。
李俊一：资源获取。
萧琳华：撰写——审稿与编辑，撰写——初稿，项目管理，方法学研究，资金争取。
关于写作过程中生成式AI和AI辅助技术的声明
作者在准备这项工作时没有使用ChatGPT来生成学术英语句子。
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文报告的工作。
致谢
作者感谢刘宇文在手稿准备方面的帮助，同时也感谢郑大俊在数据分析和手稿准备方面的协助。
涉及人类参与者和/或动物的研究
本研究涉及人类参与者。
知情同意
本研究的所有九名明显健康的参与者均签署了书面知情同意书。
