《International Biodeterioration & Biodegradation》：A novel thermostable and glucose tolerant β-glucosidase from
Caldibacillus thermoamylovorans MB12B for efficient hydrolysis of lignocellulosic biomass
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β-葡萄糖苷酶Bgl09210从嗜热菌Caldibacillus thermoamylovorans MB12B中鉴定，具有70℃高温活性、2.2M葡萄糖耐受性及强抗木质素酚类能力，协同商业酶显著提升玉米秸秆水解效率，并通过mini-Tn7系统在Pseudomonas putida中实现异源高效表达。
孟龙林|刘永轩|孙晓文|马润泽|陈晓伟|龚春杰|余勋
国家“111”细胞调控与分子制药中心，湖北工业微生物学重点实验室，发酵工程重点实验室（教育部），湖北工业大学，武汉，430068，中国
摘要
β-葡萄糖苷酶在木质纤维素生物质的酶法糖化过程中起着关键作用。优异的热稳定性、显著的葡萄糖耐受性和高催化效率是β-葡萄糖苷酶在工业应用中的重要特性。在本研究中，我们从嗜热细菌
Caldibacillus thermoamylovorans MB12B中鉴定并表征了一种新的β-葡萄糖苷酶（Bgl09210），其最佳活性温度为70°C，pH值为7.0。热稳定性测试和葡萄糖耐受性测试表明，Bgl09210表现出优异的性能，在50°C下的半衰期为153.4小时，
IC50值为2.2 M。此外，Bgl09210对木质素衍生的酚类物质（如
-香豆酸、阿魏酸和
-羟基苯甲酸）以及其他化学试剂具有很强的抗性，在5% SDS存在下仍能保持34.2%的初始活性。为了评估Bgl09210在木质纤维素生物质糖化中的潜力，我们将纯化的Bgl09210与商业纤维素酶（Cel-01）结合使用，用于水解预处理的玉米秸秆，从而将达到最大葡萄糖浓度所需的时间从48小时缩短至24小时。进一步地，我们利用改良的mini-Tn7系统将Bgl09210和半乳糖/乳糖转运蛋白LacY整合到Pseudomonas putida MB04B的染色体中，以实现异源表达。结果表明，当半乳糖作为唯一碳源时，重组菌株MB04B::Tn7-P31-LacY-Bgl09210的生长优于对照菌株。总体而言，我们的研究结果表明，来自C. thermoamylovorans MB12B的Bgl09210具有许多突出的特性，使其成为木质纤维素生物质转化和各种工业应用中具有前景的催化剂。
引言
木质纤维素生物质是生产绿色生物燃料和多种有价值平台化学品最有前途的可再生原料之一，具有经济和环境效益（Ariaeenejad等，2020；Li等，2022）。它主要由三种成分组成（纤维素、半纤维素和木质素）。在酶法糖化之前，需要对木质纤维素生物质进行预处理，以克服其固有的抗性并提高纤维素对纤维素酶的利用率（Ladeira-ázar等，2019；Meehnian等，2017）。通常采用非酶法进行预处理，而酶法则用于将预处理后的生物质水解为葡萄糖。常见的预处理方法包括物理方法（如机械处理、超声波处理和热处理）、化学方法（如酸处理、碱处理、氧化处理和有机溶剂处理）以及物理化学方法（如蒸汽爆炸和氨纤维爆炸）（Zhao等，2022）。经典的纤维素降解模型依赖于三种主要纤维素酶的协同作用：内切葡聚糖酶（EG，EC 3.2.1.4）、半纤维素水解酶（CBH，EC 3.2.1.91/176）和β-葡萄糖苷酶（BGLs，EC 3.2.1.21）。具体来说，内切葡聚糖酶作用于纤维素聚合物产生切口；半纤维素水解酶作用于纤维素的还原端和非还原端，释放出短链半纤维素寡糖和半乳糖；而β-葡萄糖苷酶最终将半纤维素寡糖或半乳糖水解为葡萄糖（CAZy数据库）。后来，随着辅助酶（如裂解多糖单加氧酶（LPMOs）和半乳糖脱氢酶（CDHs）的发现，这一模型得到了进一步改进，这些酶与纤维素酶协同作用（Barbosa等，2020）。最近，从宏基因组“暗物质”中发现的一种新型金属酶显示出在氧化和切割纤维素方面的显著生物技术潜力，进一步加深了我们对自然界中纤维素酶降解过程的理解（Santos等，2025）。
在纤维素酶中，β-葡萄糖苷酶（BGLs）被认为是纤维素酶法水解为葡萄糖过程中的关键限速酶（Kannan等，2023；Zhang等，2020）。其性能通常基于三个关键参数进行评估：葡萄糖耐受性、热稳定性和催化效率。在工业应用中，酶法糖化过程中更倾向于使用高固含量的木质纤维素生物质，这会导致葡萄糖的积累（Modenbach和Nokes，2013）。然而，BGLs极易受到葡萄糖的抑制，从而阻碍整个糖化过程（Ariaeenejad等，2020；Konar等，2019）。因此，具有强葡萄糖耐受性的BGLs非常理想，能够在高固含量的木质纤维素生物质中保持其活性（Modenbach和Nokes，2013）。此外，为了提高糖化效率并避免微生物污染，木质纤维素生物质的糖化通常在50°C或更高温度下进行（Bhalla等，2013；Cao等，2020）。因此，热稳定性也是BGLs的重要特性。嗜热微生物是热稳定纤维素酶的宝贵来源（Bhalla等，2013）。对半乳糖的高催化效率（kcat/Km）对于加速葡萄糖的生产过程也至关重要（Liu等，2019b；Zhou等，2023）。过去几十年中，提高BGLs的葡萄糖耐受性、热稳定性和催化效率一直备受关注（Li等，2023）。除了上述特性外，对木质素衍生酚类物质的耐受性也成为了一个关键因素。这些酚类物质在预处理过程中产生，可能会抑制或失活BGLs，从而影响其酶法水解性能（Jiang等，2022；Ko等，2015）。
尽管β-葡萄糖苷酶直接用于纯化酶的木质纤维素酶法糖化，但它们也是微生物全细胞生物催化剂中利用纤维素的重要生物组成部分。例如，Liang等（2014）通过在Saccharomyces cerevisiae中共表达β-葡萄糖苷酶与半乳糖脱氢酶、半纤维素水解酶、内切葡聚糖酶和裂解多糖单加氧酶（LPMOs），构建了一个五功能微型纤维素体。这种方法实现了纤维素的协同降解，使乙醇产量提高了60%，并使重组酵母能够以纤维素为唯一碳源生长。同样，在P. putida细胞表面展示来自嗜热细菌Ruminiclostridium thermocellum的β-葡萄糖苷酶、外切纤维素酶和内切纤维素酶，实现了纤维素底物向葡萄糖的协同水解（Tozakidis等，2016）。
在本研究中，我们从之前我们团队报道的具有优异纤维素降解和木质素降解能力的嗜热细菌
Caldibacillus thermoamylovorans MB12B中鉴定出一种新的β-葡萄糖苷酶（Bgl09210）。详细研究了Bgl09210的酶学性质，包括其最佳pH值、最佳温度、热稳定性以及对
-硝基苯基-β-吡喃糖苷（
NPG）和半乳糖的动力学参数。此外，还评估了其对葡萄糖和木质素衍生酚类物质的耐受性，以及金属离子和其他化学试剂的影响，以确定其工业潜力。此外，将纯化的Bgl09210与商业纤维素酶（Cel-01）结合使用，以提高预处理玉米秸秆的水解效率。最后，使用mini-Tn7转座子系统将Bgl09210整合到具有高Mn(II)氧化活性和强底物耐受性的土壤细菌Pseudomonas putida MB04B的染色体中（Liu等，2023，2025）。随后使用半乳糖作为唯一碳源，研究了重组P. putida菌株的生长情况。
部分摘要
细菌菌株、质粒、引物、生长条件和化学品
本研究中使用的菌株和质粒列于表S1中，寡核苷酸引物列于表S2中。大肠杆菌菌株和野生型C. thermoamylovorans MB12B（中国武汉微生物遗传资源中心）在37°C下常规培养于Luria-Bertani培养基中（Sun等，2023），而P. putida MB04B及其衍生菌株在30°C下培养（Liu等，2023）。为了评估在半乳糖上的生长情况，对P. putida MB04B进行了接种C. thermoamylovorans MB12B中β-葡萄糖苷酶的鉴定与表征
在我们之前的工作中，我们从花园废弃物堆肥环境中分离出一种嗜热细菌Caldibacillus thermoamylovorans MB12B，该细菌具有优异的纤维素降解和木质素降解能力（Sun等，2023）。为了鉴定C. thermoamylovorans MB12B中的β-葡萄糖苷酶，我们使用Clostridium cellulovorans中的β-葡萄糖苷酶CcBglA（Jeng等，2011）和Thermobifida fusca中的BglC（Mu?oz-Gutiérrez等，2014）作为模板进行了BlastP搜索
讨论
在木质纤维素生物质的转化过程中，水解纤维素通常需要三种关键酶的协同作用：内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶，其中β-葡萄糖苷酶通常被认为是主要的限速酶（Salgado等，2018）。最近，具有优异催化性能（如高葡萄糖耐受性和强热稳定性）的天然β-葡萄糖苷酶的鉴定和蛋白质工程引起了广泛关注（Cao等，
结论
总结来说，我们从嗜热细菌C. thermoamylovorans MB12B中鉴定出一种新的β-葡萄糖苷酶（Bgl09210），该酶具有多种优异特性，如高热稳定性、强葡萄糖耐受性、对木质素衍生酚类物质的强耐受性和对半乳糖的高催化效率。将Bgl09210与商业纤维素酶Cel-01结合使用，显著缩短了从玉米秸秆中释放最大葡萄糖所需的时间。通过
CRediT作者贡献声明
孟龙林：撰写——原始草稿、数据可视化、数据分析。
刘永轩：撰写——原始草稿、数据分析。
孙晓文：数据可视化、资源获取。
马润泽：方法验证。
陈晓伟：方法验证。
龚春杰：资源获取、数据分析。
余勋：撰写——审稿与编辑、监督、资源管理、项目协调、资金获取、概念构思。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的财务利益或个人关系。
致谢
本研究得到了湖北工业大学国家“111”细胞调控与分子制药中心的合作资助（XBTK-2024011）、湖北工业微生物学重点实验室的开放项目资助（2023KF02）、发酵工程重点实验室（教育部）的开放项目资助（202409FE21）以及湖北工业大学博士项目的资助（XJ2023004601）的支持。
