苯肾上腺素通过Foxh1/GSK-3β/β-连环蛋白介导的ARDS患者肺泡上皮细胞分化作用，减轻LPS（脂多糖）诱导的肺损伤

《International Immunopharmacology》：Phenylephrine attenuates LPS-induced lung injury via Foxh1/GSK-3β/β-catenin-mediated alveolar epithelial cell differentiation in ARDS

苯乙酚通过激活Foxh1/GSK-3β/β-catenin信号通路促进肺泡上皮细胞分化减轻急性呼吸窘迫综合征肺损伤

　　

曾昭进|尹一园|丛竹凯|魏森豪|魏晓云|沈子远|葛庆刚|朱曦

中国北京北京大学第三医院重症监护病房

摘要

背景

急性呼吸窘迫综合征（ARDS）是一种由严重肺炎症和进行性肺泡上皮损伤引起的低氧性呼吸衰竭，目前尚缺乏有效的治疗方法。我们之前的研究表明，α₁-肾上腺素受体（α₁-AR）激动剂去甲肾上腺素（PE）可以通过抑制肺泡巨噬细胞的炎症来缓解ARDS小鼠中的脂多糖（LPS）诱导的肺损伤。然而，肺泡上皮细胞（AECs）——作为血气屏障的关键组成部分——是否对PE的肺保护作用有所贡献，这一点尚不清楚。

方法

通过气管内注射LPS建立急性肺损伤模型，随后进行PE干预。使用H&E染色和TUNEL染色评估肺损伤，同时通过ELISA检测肺组织和血清中的炎症因子。通过免疫荧光和Western blot检测肺泡上皮的分化情况。随后，利用转录组测序鉴定参与细胞分化的关键调控蛋白Foxh1，并通过Western blot和共免疫沉淀实验进一步研究其下游通路。

结果

结果表明，PE显著减轻了ARDS中的肺损伤，并促进了AECs向I型肺泡细胞（AT1细胞）的分化。转录组测序显示，PE在LPS诱导的AECs中上调了Forkhead box蛋白H1（Foxh1）的表达。机制上，Foxh1通过抑制GSK-3β的活性来增强β-连环蛋白的表达，从而阻断LPS诱导的β-连环蛋白的泛素化降解，驱动AECs的分化。

结论

总之，PE通过激活Foxh1/GSK-3β/β-连环蛋白信号通路，促进AECs向AT1细胞分化，从而减轻ARDS中的LPS诱导的肺损伤。

引言

急性呼吸窘迫综合征（ARDS）和急性肺损伤（ALI）是由严重炎症反应引发的危及生命的危重疾病，会导致肺泡上皮功能逐渐受损[1]，[2]。这些综合征的特点是肺泡弥漫性损伤、肺水肿和难治性低氧血症，目前缺乏有效的治疗手段[3]。ARDS/ALI的病理生理过程涉及炎症介质级联反应、细胞损伤和功能障碍，最终导致高死亡率及不良临床结局[2]。

最近，肾上腺素受体（ARs）作为儿茶酚胺类药物的关键靶点，成为理解ARDS发病机制和开发药物治疗的新方向[4]。我们的初步研究表明，在LPS诱导的小鼠ARDS模型中，给予α1-肾上腺素受体（α1-AR）激动剂去甲肾上腺素（PE）可以有效减轻巨噬细胞介导的炎症并缓解肺损伤[5]，这表明其在ARDS/ALI中的治疗潜力。然而，PE是否也通过调节肺泡上皮细胞功能来发挥保护作用仍不清楚。

在ARDS的初期阶段，肺泡上皮细胞（AECs）——作为血气屏障的重要组成部分——是抵御肺屏障损伤的主要靶点和第一道防线[6]，[7]。它们的损伤程度直接影响ARDS的进展[8]。肺泡上皮包括I型（AT1）细胞和II型（AT2）细胞[9]。肺损伤后，AT2细胞迅速增殖并分化为AT1细胞（介导屏障/气体交换功能），从而重新上皮化受损的肺泡，恢复肺泡结构，维持结构完整性，并防止进一步损伤[10]，[11]，[12]，[13]。因此，我们通过转录组测序研究了肺泡上皮的反应，并发现Foxh1是PE干预后LPS损伤肺泡上皮细胞中变化最显著的基因之一。Foxh1是一种Forkhead box转录因子，在胚胎发育和基因调控中起关键作用，调节细胞增殖、分化和凋亡[14]，[15]，[16]。尽管此前没有研究将Foxh1与ARDS的发病机制联系起来，但现有证据表明它在细胞重编程过程中能够增强上皮标记物的表达同时抑制间充质基因的表达[17]，[18]——这表明Foxh1在肺损伤修复过程中参与了肺泡上皮的分化。

β-连环蛋白是Wnt信号通路的关键调节因子，调控多种生理过程，包括细胞增殖和分化[19]。该通路的失调与影响肺、心脏、肝脏、骨骼和神经系统的多系统疾病有关[20]。值得注意的是，越来越多的证据表明，上调β-连环蛋白的表达可以缓解各种原因引起的ALI[21]，[22]，[23]。Wnt/β-连环蛋白微环境对于维持AT2细胞的干性以及在肺修复过程中驱动AT2细胞向AT1细胞分化至关重要[13]。GSK-3β是一种进化上保守的丝氨酸/苏氨酸激酶，调节细胞增殖、DNA修复和信号转导[24]。它通过降解β-连环蛋白来防止病理性的过度激活[25]。重要的是，β-连环蛋白的缺乏/功能障碍是ARDS/ALI进展的关键驱动因素。

鉴于Foxh1和β-连环蛋白在细胞分化过程中的相互作用[26]，[27]，[28]，我们假设它们的功能相互作用介导了ARDS中的肺泡上皮修复。本研究采用转录组学和分子生物学方法，在LPS损伤的肺泡上皮和ARDS小鼠模型中阐明了PE通过Foxh1/β-连环蛋白轴发挥保护作用的机制。

抗体和试剂

使用的抗体包括：兔抗β-连环蛋白（Proteintech，51067）、兔抗Foxh1（Immunoway，YT1679）、鼠抗β-肌动蛋白（Proteintech，66009）、兔抗SPC（Proteintech，10774）、兔抗AQP5（Proteintech，20334）、鼠抗AQP5（Santa Cruz Biotechnology，sc-514022）、鼠抗Lamin B1（Proteintech，66095）、兔抗ATP1A1（Proteintech，55187）、鼠抗微管蛋白（Proteintech，66031）、兔抗泛素（Proteintech，10201）、兔抗GSK3B（Proteintech，22104）以及鼠抗...

PE在体内减轻了LPS诱导的肺损伤

与我们的先前研究结果一致[5]，LPS导致了显著的肺组织损伤，表现为肺泡隔增厚、肺泡融合、间质水肿和炎症细胞浸润。这些病理变化通过使用α₁-AR特异性激动剂PE干预得到了显著改善（图1A，B）。此外，PE干预还有效减少了肺组织中的细胞凋亡（图1C，D）。此外，肺组织中的炎症细胞因子TNF-α和IL-1β的水平也有所下降

讨论

在本研究中，我们发现PE通过促进AECs的分化来减轻LPS诱导的肺损伤。机制上，PE上调了肺泡上皮中的Foxh1表达，从而抑制了GSK-3β的活性，阻止了LPS诱导的β-连环蛋白的泛素化降解。这一级联反应促进了肺泡上皮向AT1细胞的分化，恢复了肺泡结构并维持了上皮完整性，减轻了ARDS中的肺损伤。

PE是一种α1-AR激动剂，之前的研究已经表明...

CRediT作者贡献声明

曾昭进：撰写——原始草案、数据管理、概念构思、方法学。尹一园：软件应用、方法学。丛竹凯：方法学、资金获取。魏森豪：方法学。魏晓云：方法学。沈子远：验证。葛庆刚：撰写——审稿与编辑、资源提供、概念构思。朱曦：撰写——审稿与编辑、资源提供、资金获取、概念构思。

伦理批准

该研究方案已获得北京大学健康科学中心动物护理和科学委员会的批准（批准编号：SA2020336）。

资金来源

本研究得到了国家自然科学基金（项目编号：82172166）、北京市自然科学基金（项目编号：7212130）以及国家自然科学基金青年科学家基金（项目编号：82301442）的支持。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

我们感谢北京大学第三医院重症监护病房和北京大学第三医院医学创新与研究所的同事们在本研究中的慷慨支持。