《International Immunopharmacology》：Gambogenic acid suppresses T cell proliferation via inhibition of ERK signaling pathway
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GNA通过抑制ERK信号通路抑制激活T细胞增殖，改善米器曲明诱导的银屑病样皮炎。
王玉江|罗星彦|陈宏宇|王欣宇|黄志敏|冯凯宇|莫春芬|郭慧杰|杨淑霞|王彦堂|刘阳
中国四川省成都市成都医学院第一附属医院胃肠病学系，邮编610500
摘要
背景与目的
近期研究强调了来自传统中医（TCM）的单体在自身免疫性疾病中的治疗潜力。通过筛选，我们发现中药单体Gambogenic acid具有显著的免疫抑制活性。本研究阐明了GNA在体外抑制T细胞增殖的机制，并评估了其对抗伊莫昔莫德（IMQ）诱导的类似银屑病的皮肤炎症的效果。
实验方法
通过流式细胞术分析了T细胞的毒性、凋亡、CD25表达和细胞周期分布。细胞因子水平通过ELISA测定，信号分子的磷酸化通过Western blot评估。使用BALB/c小鼠模型来评估IMQ诱导的类似银屑病的皮肤炎症的体内效果。
结果
GNA以剂量依赖的方式抑制了抗CD3/CD28单克隆抗体刺激的人类T细胞增殖（P < 0.01），且无细胞毒性。它抑制了CD25的表达和促炎细胞因子（IL-2、IL-6、IFN-γ、IL-17A）的分泌（P < 0.05），并使活化T细胞停留在G0/G1期。在机制上，GNA选择性地阻断了ERK的磷酸化（P < 0.01），而不影响GSK-3β、NF-κB或p38 MAPK信号通路。在体内，GNA显著改善了IMQ诱导的银屑病病变，减少了表皮增生和炎症浸润（P < 0.01）。
结论与意义
我们的发现表明，GNA通过靶向ERK信号通路抑制T细胞活化，显示出其作为中药衍生免疫抑制单体的潜力，可用于预防器官移植排斥和治疗自身免疫性疾病。本研究为基于GNA的疗法开发奠定了基础。
引言
Gamboge树脂在民间医学中传统上被用于治疗慢性皮炎、痔疮、褥疮和绦虫感染[1]。Gambogic acid（GA）被确定为Garcinia hanburyi树脂渗出物的主要生物活性成分。Gambogenic acid（GNA）被结构确定为Gambogic acid的二萜衍生物。GNA与GA在结构上有相似性，但不同之处在于GNA含有香叶基团和羟基，而GA含有醚环[2]。
新兴的研究表明，GNA具有多种生物活性，在临床前模型中显示出抗肿瘤效果。机制研究表明，GNA通过上调Noxa（phorbol-12-myristate-13-acetate诱导的蛋白1）诱导口腔鳞状细胞癌（OSCC）中的促凋亡效应，随后通过激活Bcl-2同源域触发线粒体介导的凋亡[3]。作为强效的表观遗传调节剂，GNA通过表观遗传方式抑制EZH2介导的组蛋白H3第27位赖氨酸的三甲基化，从而恢复TGF-β1/Smad7轴组分的Smad7依赖性信号通路[4]，[5]。GNA通过阻断巨噬细胞中的NF-κB和MAPK通路来抑制LPS诱导的炎症。此外，它通过PI3K/Akt和NF-κB信号通路调节的抗炎和抗凋亡作用保护肝脏免受对乙酰氨基酚（APAP）的损伤[6]，[7]，[8]。GNA通过多种机制显著减轻肥大性瘢痕形成，包括抑制病理性新生血管形成、减轻局部炎症反应以及降低伤口愈合过程中瘢痕组织中的促纤维化生长因子表达[9]。与GA相比，GNA表现出更强的抗肿瘤效果和更低的系统毒性[10]。虽然GNA的免疫抑制活性之前未被报道，但我们的筛选揭示了其对T细胞增殖的显著抑制作用。
银屑病是一种慢性炎症性皮肤病，其特征是病理性血管生成、角质形成细胞过度增殖和生活质量下降。研究表明，T细胞介导的炎症，特别是Th1/Th17细胞的活化，在其发病机制中起关键作用[12]，[13]。致病刺激物触发抗原呈递细胞（APCs）释放促炎细胞因子（IL-23、IFN-α、IL-12），这些细胞因子激活T淋巴细胞并驱动其分化为病理性的Th1/Th17亚群。这些效应T细胞随后产生炎症介质（TNF-α、IFN-γ、IL-17、IL-22），通过角质形成细胞靶向的信号通路放大银屑病炎症[13]，[14]，[15]。免疫抑制剂通过调节关键信号通路和抑制免疫细胞过度增殖发挥治疗效果。值得注意的是，MAPK成员（p38、JNK、ERK1/2）的过度活化已被证明可以通过AP-1转录激活来调节银屑病炎症介质，这些激酶成为经过验证的治疗靶点[16]。
目前的临床实践优先使用免疫抑制剂，例如抗IL-33单克隆抗体（mAb），该抗体显著下调银屑病相关细胞因子的表达，在缓解红斑、脱屑、表皮增生和脾肿大方面显示出疗效[17]。来自中药的生物活性成分和单体化合物已成为治疗银屑病发病机制的有希望的候选药物，通过调节炎症级联反应和异常免疫反应显示出免疫调节效果，这一点已在类似银屑病的临床前模型中得到验证[18]。由于触发因素和药理敏感性的个体间差异显著，当单药治疗效果不佳时，需要联合、轮换或序贯治疗[19]。虽然传统免疫抑制剂在银屑病治疗中仍具有临床效果，但其应用常常受到多器官不良反应的困扰；相比之下，具有明确化学结构的中药衍生单体化合物通过靶向信号调节发挥治疗效果，表现出良好的安全性[20]。当与其他免疫抑制剂联合使用时，这些化合物可以协同增强治疗效果，同时降低系统毒性。因此，扩展具有免疫调节特性的中药衍生单体库将为需要个性化治疗方案的银屑病患者提供更多治疗选择。
在这项研究中，我们发现GNA通过抑制ERK信号通路抑制T细胞增殖，而不诱导T细胞凋亡。在伊莫昔莫德诱导的银屑病小鼠模型中，GNA显著缓解了类似银屑病的皮肤炎症。GNA是从Garcinia果实的树脂中分离出的单体化合物。这项研究为阐明Garcinia树脂的药理活性成分提供了见解，并为其全面开发和利用提供了科学依据。作为先导化合物，GNA可能指导新型免疫抑制药物的开发，并为揭示新的发病机制提供理论和实验基础。
试剂和抗体
| 试剂 | 来源 | 标识符 |
|---|
Gambogenic acid
抗人CD3功能级纯化
抗人CD28功能级纯化
抗人CD25抗体APC
Lympphoprep
Annexin V-FITC
细胞周期和凋亡分析试剂盒
CFSE细胞分裂追踪试剂盒
ERK
p-ERK
AKT
p-AKT
GSK-3β
p-GSK-3β
p38 MAPK
p-p38 MAPK
NF-κB
p-NF-κB
p-MEK
MEK
CDK6
Cyclin D3
伊莫昔莫德霜
抗鼠CD4-FITC
抗鼠IL-17A-BV421
抗鼠IFN-γ-APC | MedChemExpress
ebioscience
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Axis-Shield
Beyotime
Beyotime
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GNA显著抑制活化T细胞的增殖，且无显著细胞毒性
使用CFSE标记结合流式细胞术评估了GNA对由抗CD3/CD28单克隆抗体和T细胞刺激的人类T细胞增殖的抑制作用（图1A）。结果显示，GNA以剂量依赖的方式抑制了由抗CD3/CD28单克隆抗体刺激的人类T细胞的增殖，半数抑制浓度（IC50）为1 ± 0.17 μM（图1B）。同时，GNA也以剂量依赖的方式抑制了T细胞的增殖
讨论
在这项研究中，我们发现GNA显著抑制了由抗人CD3/CD28 mAb刺激的人类T细胞的增殖。在完全抑制活化T细胞增殖的浓度下，GNA对静息T细胞没有毒性，也没有诱导活化T细胞的凋亡，表明GNA具有免疫抑制作用而非细胞毒性。
CD25和IL-2在T细胞活化中起关键作用，是评估T细胞状态的关键生物标志物
结论
总体而言，Gambogenic acid（GNA）通过抑制ERK信号通路介导的T细胞增殖来改善伊莫昔莫德诱导的银屑病。这些发现强调了GNA作为免疫调节剂的潜力，其核心结构可作为开发新型免疫抑制治疗药物的先导化合物。在机制上，我们的研究不仅为银屑病发病机制中ERK驱动的T细胞失调提供了基础见解，还为
CRediT作者贡献声明
王玉江：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，方法学，实验研究，数据分析。罗星彦：验证，资源获取，方法学，实验研究。陈宏宇：方法学，实验研究，数据分析。王欣宇：验证，方法学，数据分析。黄志敏：方法学，实验研究，数据分析。冯凯宇：方法学，实验研究，数据分析。莫春芬：验证，资源获取，资金申请。郭慧杰：验证，
写作过程中使用生成式AI和AI辅助技术的声明
作者声明，在本手稿的写作过程中使用了AI辅助技术来润色语言。
资助
本工作得到了四川省科学技术厅（编号：2024NSFSC0735）；成都医学院优秀人才计划（编号：2024kjTzn04）；以及成都医学院研究基金（编号：CYZYB25–13）的支持。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的竞争性财务利益或个人关系。
