《International Immunopharmacology》：HO-1 relied on PI3K/mTOR signaling to alleviate inflammation by reducing the apoptosis and autophagy of bovine mammary epithelial cells
编辑推荐：
HO-1通过PI3K/mTOR信号通路抑制LPS诱导的牛乳腺上皮细胞凋亡和自噬，降低炎症因子IL-6、IL-8和TNF-α表达，提高细胞增殖和抗炎能力。
王月英|张欣怡|徐淑辉|景俊贤|刘晓晓|杨启龙|彭代|黄琳琳|孙翔|刘阳|李和平|韩英倩
中国河南省郑州市450046，河南农业大学兽医学院，农业部动物生物化学与营养重点实验室。
摘要
牛乳腺炎是一种炎症性疾病，会激活牛乳腺上皮细胞（bMECs）的凋亡和自噬。HO-1是细胞和组织稳态反应的关键调节因子，具有抗凋亡、抗炎和自噬调节功能。PI3K/mTOR信号通路是调节细胞自噬和凋亡的关键途径。因此，我们假设HO-1通过减少bMECs中的自噬和凋亡来发挥抗炎作用。我们使用LPS处理bMECs以建立炎症细胞模型，随后再给予HO-1处理。通过RT-PCR、ELISA、Western blotting、透射电子显微镜和流式细胞术等方法检测细胞炎症、凋亡和自噬水平的变化。此外，在LPS处理前给予PI3K或mTOR抑制剂和HO-1，评估了HO-1对凋亡和自噬活性的调节作用。结果发现，HO-1增加了bMECs的增殖，并减轻了bMECs的炎症反应，显著降低了LPS诱导的促炎因子（IL-6、IL-8和TNF-α）的mRNA丰度和含量。此外，HO-1还表现出抗凋亡和抗自噬作用。更重要的是，HO-1的保护作用依赖于PI3K/mTOR信号通路来介导凋亡和自噬。这些数据表明，HO-1具有强大的抗炎特性，能够激活PI3K/mTOR信号通路并抑制bMECs中的炎症诱导的凋亡和自噬。因此，HO-1可以作为治疗牛乳腺炎的有效临床药物。
引言
牛乳腺炎由于发病率高、治疗费用昂贵以及预防和管理的困难，给乳品行业带来了巨大的经济负担。饮用受乳腺炎污染的牛奶对人体有害，因为微生物病原体可能通过牛奶传播，这也是一个重大的公共卫生问题[1]、[2]、[3]。炎症反应通常伴随着细胞凋亡和自噬[4]。牛乳腺炎不仅会导致炎症和组织损伤，还会激活牛乳腺上皮细胞（bMECs）的凋亡和自噬，影响细胞数量，最终降低牛奶产量[5]、[6]。因此，有效调节细胞炎症、凋亡和自噬对于预防或治疗乳腺炎的发生至关重要。
血红素加氧酶-1（HO-1）催化血红素分解的第一步且是限速步骤，这一过程与细胞抗氧化防御、抗凋亡、抗炎和自噬调节功能相协调[7]、[8]、[9]、[10]。在生理条件下，大多数细胞和组织中HO-1的表达较低或不存在，但在哺乳动物的脾脏和肝脏中表达较高[11]。当暴露于有害刺激时，HO-1的表达会增加以应对氧化应激[7]。多项体外研究表明，HO-1会被IL-1、TNF-α和脂多糖（LPS）等炎症分子上调，这些分子可以抑制IL-1β诱导的细胞凋亡[12]。HO-1通过介导细胞自噬来保护肝细胞和肺内皮细胞免于细胞死亡[13]、[14]。最近的研究还证实，HO-1通过激活自噬来减少凋亡[15]、[16]。有趣的是，多项研究表明患乳腺炎的牛乳腺处于氧化应激状态[6]、[17]、[18]。然而，关于HO-1在bMECs中调节自噬和凋亡的作用及其机制尚不清楚。
PI3K（磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B）/mTOR信号通路对调节细胞自噬和凋亡至关重要[19]。先前的文献发现，HO-1依赖于PI3K/mTOR信号通路来调节细胞炎症、凋亡和自噬[20]、[21]。由于LPS是免疫应激的主要来源，通常用于建立体内和体外的炎症模型。因此，我们假设PI3K/mTOR信号通路参与了HO-1在LPS刺激的bMECs中的抗炎作用，通过调节凋亡和自噬来实现。我们建立了炎症细胞模型，即先对bMECs进行LPS处理，然后再给予HO-1处理。使用RT-PCR、ELISA、Western blotting、透射电子显微镜和流式细胞术等方法检测细胞炎症、凋亡和自噬水平的变化。通过阻断PI3K或mTOR信号通路，评估了HO-1对凋亡和自噬活性的调节作用。本研究将为HO-1在预防和治疗牛乳腺炎中的应用提供科学依据。
细胞培养和细胞活力检测
bMECs来源于实验室分离的牛乳腺上皮细胞。细胞在细胞培养箱（37°C，5% CO2）中用高葡萄糖DMEM培养基（含有FBS）进行培养。FBS和高葡萄糖DMEM培养基分别来自Solarbio Life Sciences和浙江天航生物技术有限公司。将9 × 104个细胞/孔的细胞接种到96孔板中，融合率达到70%～80%的细胞被暴露于不同剂量的HO-1（0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 μg/mL，来自北京）
确定用于处理bMECs的HO-1浓度
不同浓度的HO-1被用于处理bMECs，时间分别为12小时和24小时。如图1所示，0.06、0.08和0.10 μg/mL的HO-1显著提高了bMECs的活力，而0.04 μg/mL的HO-1对细胞活力没有显著影响（P > 0.05）。这表明HO-1的促活力作用具有浓度和时间依赖性。根据我们之前的文献[22]、[23]、[24]以及上述细胞活力结果，bMECs被暴露于0.06 μg/mL的HO-1中
讨论
炎症是组织稳态受到病原体、污染物或组织损伤刺激时常见的过程，其目的是消除刺激并恢复组织稳态[30]。因此，核转录因子κB（NF-κB）被转移到细胞核中，进一步触发级联反应的下一阶段，包括分泌促炎细胞因子（如IL-6、IL-1 β、TNF-α等）[31]。这一机制与最近的毒理学研究结果一致
结论
总之，我们的结果表明HO-1促进了bMECs的增殖，并表现出明显的抗炎作用。此外，HO-1还表现出抗凋亡和抗自噬作用。本研究显示，HO-1调节了LPS激活的凋亡和自噬，包括降低caspase-3和Bax的表达，增加Bcl-2的表达，减少凋亡比率，降低LC3 II/I和Beclin-1的表达，增加p62的表达，以及
患者发表同意书
不适用。
CRediT作者贡献声明
王月英：写作 – 审稿与编辑，撰写原始稿件，数据可视化，软件使用，项目管理，概念构思。
张欣怡：方法学设计，实验研究，数据分析。
徐淑辉：方法学设计，实验研究。
景俊贤：方法学设计，实验研究。
刘晓晓：数据可视化，软件使用，数据管理。
杨启龙：数据可视化，软件使用，数据管理。
彭代：方法学设计，数据分析。
黄琳琳：数据可视化，软件使用。
伦理批准和参与同意
本文不包含任何作者进行的涉及人类受试者或动物的研究。所有实验方案均获得了河南农业大学兽医学院伦理委员会的批准（中国郑州）。
致谢
本研究得到了国家自然科学基金（编号：32272958、32172809）和河南省自然科学基金（编号：262300421487）的财政支持。资助机构未参与研究设计、数据收集、数据解释或决定提交论文发表。
