《International Journal of Antimicrobial Agents》：Spontaneous mutations to delamanid and pretomanid resistance in
Mycobacterium tuberculosis: SNPs confer high-level resistance
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耐多药结核分枝杆菌体外筛选显示DLM和PMD存在高交叉耐药性，鉴定出111个耐药相关突变（含非错义SNP、LoF突变及移码内插缺失），其中仅6个此前有报道。
钱张|彭旭|张学聪|皮睿|陈一旺|霍华德·塔基夫|高倩
中国深圳市第三人民医院结核病临床研究中心，国家传染病临床研究中心
摘要
目的
耐多药结核病（MDR-TB）仍然是全球主要的健康威胁。德拉马尼德（DLM）和普雷托马尼德（PMD）是新型MDR-TB治疗方案中的核心药物，但其耐药突变谱尚不明确。
方法
为了研究这些突变，我们进行了五项平行的体外实验，分别针对DLM和PMD的耐药性。将结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）H37Rv菌株接种在DLM（0.4 μg/mL）或PMD（4 μg/mL）的两倍临界浓度（CC）上，以筛选出耐药克隆。通过最小抑菌浓度（MIC）测试量化耐药性，并对合并的及单个克隆进行全基因组测序（WGS），以识别与药物耐药性相关的突变。
结果
每项平行实验产生了约150个DLM耐药克隆和200个PMD耐药克隆。合并克隆的WGS检测出6个与耐药性相关的基因（ddn、fgd1、fbiA、fbiB、fbiC、fbiD）中的102个突变。259个单个克隆的MIC检测显示广泛的DLM-PMD交叉耐药性，大多数分离株对两种药物均表现出高水平耐药性（MIC ≥ 32 × CC，DLM ≥ 6.4 μg/mL，PMD ≥ 64 μg/mL）。对100个随机选择的单个克隆进行WGS后发现，非同义单核苷酸多态性（SNPs）、功能丧失（LoF）突变和框内插入/缺失（inframe indels）均会导致高水平耐药性。在鉴定出的111个突变中，只有6个在之前的体外筛选研究中被报道过。根据WHO的突变目录，14个LoF突变被确认为耐药突变。
结论
总之，体外筛选显示了高度多样的耐药突变。大多数突变，包括SNPs，都导致对DLM和PMD的耐药性。
引言
结核病（TB）仍然是全球主要的健康挑战，尽管在治疗和控制措施方面取得了进展，但它仍然是世界上最致命的传染病[1]。耐药性结核病是治疗失败的关键因素[2]，对于耐多药/利福平耐药性结核病（MDR/RR-TB）患者，治疗成功率仅为68%[3]。然而，近年来，新抗结核药物贝达喹啉（BDQ）、德拉马尼德（DLM）和普雷托马尼德（PMD）的引入显著改善了耐药性结核病的治疗效果。基于这些新药物的方案显著提高了耐药性结核病的治疗成功率[4,5]，并使得治疗方案更加简短且完全口服[4,6]。
然而，自从DLM和PMD被引入临床治疗以来，多个国家报告了感染这些药物耐药性结核菌株的病例。这些病例包括在治疗过程中产生的获得性或继发性耐药性，以及传播性耐药性[7]。因此，为了设计有效的治疗方案并减少耐药性结核病的传播，快速准确地检测DLM和PMD耐药性至关重要。基于已知耐药突变（DRMs）的基因型药物敏感性检测（gDST）方法快速且生物安全，已成为预测结核分枝杆菌（MTB）临床分离株药物敏感性的重要工具。然而，根据WHO的DRMs目录，DLM的gDST灵敏度仅为14.7%[8]，远低于临床应用所需的≥80%的灵敏度[9]。这种低灵敏度的明显原因是许多导致DLM耐药的突变尚未被识别。
DLM和PMD属于硝基咪唑类药物，通过抑制细胞壁合成并诱导一氧化氮的释放来杀死MTB[10][11][12]。作为前药，DLM和PMD需要Ddn酶和F420辅因子的激活[13]。因此，在合成Ddn酶和F420辅因子的基因（ddn、fgd1、fbiA、fbiB、fbiC和fbiD）中发现了导致DLM和PMD耐药的突变，其中大多数突变同时导致对这两种药物的耐药性[14,15]。目前，WHO的高置信度DRMs目录仅包括这六个基因中的功能丧失（LoF）突变（移码、基因缺失和提前终止密码子），以及非同义的ddn L49P突变。大量非同义突变被归类为“意义不确定”[8]。由于分析的DLM耐药性临床结核菌株相对较少，目前关于DLM和PMD耐药性的突变目录较为有限，因此gDST预测耐药性的灵敏度较低。
一种有用的策略是在含有药物的培养基上体外筛选耐药性MTB[16,17]。这种策略可以排除多种遗传背景的影响，从而更容易快速识别负责的DRMs。目前，只有少数研究使用这种方法来鉴定导致DLM和PMD耐药的突变，且大多数研究没有探讨DLM和PMD之间的交叉耐药性，也没有研究所有已知与DLM/PMD耐药性相关的基因[18][19][20][21]。在我们的研究中，我们使用DLM和PMD筛选出耐药克隆，测量了它们对DLM和PMD的最小抑菌浓度（MIC），并对单个和合并克隆样本进行了全基因组测序（WGS），以确定负责的DRMs。
章节片段
菌株和培养基
结核分枝杆菌H37Rv菌株在添加了10%油酸-白蛋白-葡萄糖-过氧化氢酶（OADC）、0.5%甘油和0.04% Tyloxapol的Middlebrook 7H9肉汤培养基（BD，美国）中生长。H37Rv也在添加了10% OADC和0.5%甘油的Middlebrook 7H11琼脂（BD，美国）中生长，并根据需要添加了DLM或PMD。体外筛选耐药克隆
使用H37Rv进行了五项平行的体外筛选实验（图1）。在每个实验中，将H37Rv接种到OD600为0.02的7H9-OADC液体培养基中。DLM和PMD耐药克隆
为了独立筛选DLM和PMD耐药克隆，使用H37Rv进行了五项平行的筛选实验（图1）。在未稀释的细菌悬浮液接种的平板上，每项平行实验产生了大约150个DLM耐药克隆和大约200个PMD耐药克隆。在10倍稀释的细菌悬浮液接种的平板上，从五项平行实验的DLM药物平板中共回收了121个耐药克隆。讨论
本研究使用合并克隆和单个克隆的WGS策略，在含有DLM或PMD的固体培养基上筛选出的近2000个克隆中鉴定出111个不同的DRMs。DLM和PMD的交叉耐药性很常见，大多数突变导致对两种药物的高水平耐药性（MIC ≥ 32 × CC，DLM ≥ 6.4 μg/mL，PMD ≥ 64 μg/mL）。鉴定出的大多数突变是非同义SNPs，这些突变以及LoF突变和框内插入/缺失突变均可导致对DLM的高水平耐药性。
资助
本研究得到了深圳市医学研究基金（编号：B2503009）、深圳市高水平医院建设基金（编号：G2022157）、深圳市结核病临床研究中心（编号：20210617141509001）、深圳市科技计划（编号：JCYJ20230807153604010）和深圳市第三人民医院研究基金（编号：25260G1006）的支持。资助方未参与研究设计、数据收集与分析、发表决定或手稿准备。
