利用深共晶溶剂进行硫酸壳聚糖的绿色合成及其在伤口愈合中的应用

《International Journal of Biological Macromolecules》：Green synthesis of chitosan sulfate using deep eutectic solvent and its application in wound healing

采用硫酸氨基甲酸-尿素深共晶溶剂法合成具有可控磺化模式的 watersoluble磺化壳聚糖（SCS），解决了传统磺化方法毒性高、磺化不可控等问题。实验证实SCS能促进细胞迁移，增强TGF-β1/VEGF分泌，加速小鼠全层皮肤伤口愈合，其中6-O-SCS的愈合效果达96.2%。该方法为可持续制备高活性仿肝素材料提供了新途径。

　　

Jing Zhang|Yiming Chen|Wenya Meng|Huifang Liu|Jing Li|Long Yu|Ping Dong

中国海洋大学食品科学与工程学院，青岛，266003，中国

摘要

壳聚糖（CS）在伤口愈合中的生物医学潜力受到其较差的溶解性和加工性的限制。本文报道了一种绿色且高效的方法，利用磺胺酸-尿素深共晶溶剂（DES）合成具有可控磺化模式的水溶性磺化壳聚糖（SCS）。通过综合表征（FTIR、¹³C和HSQC NMR、HPSEC-MALLS-RI以及元素分析）验证了其可调的磺化程度和分子量，而ζ电位进一步阐明了相应的表面性质。生物学评估表明，SCS具有优异的生物相容性，能够促进细胞迁移，增强TGF-β1/VEGF的分泌，并促进血管生成、胶原沉积和细胞外基质重塑。结构-活性分析显示，磺化模式决定了其生物活性，其中6-O-磺化SCS在处理后12天的伤口闭合率显著高于对照组（96.2% vs 88.6%）。本研究提供了一种可持续的SCS生产方法，并突出了其在伤口管理中的治疗潜力。

引言

壳聚糖（CS）是一种天然的阳离子多糖，由于其优异的生物相容性、生物降解性和固有的抗菌活性，在生物医学领域（如伤口敷料开发）受到了广泛关注[1]、[2]、[3]。然而，其有限的溶解性和高粘度限制了其反应性和加工性，从而阻碍了其在伤口修复中的有效应用[3]。最近的磺化修饰研究表明，CS的生物功能性得到了显著提升[4]。通过引入磺酸基团来模拟肝素样结构，磺化壳聚糖（SCS）衍生物的水溶性得到改善，并获得了与关键生长因子（例如EGF、FGF-2）和抗炎巨噬细胞的特异性结合能力[5]。SCS表现出多种生物活性，包括炎症调节[7]、血管生成促进[6]和成骨潜力[8]。先前的研究报道了含有SCS的水凝胶[9]和海绵[10]具有伤口愈合效果，但这些复合材料本身引入了额外的活性成分，且交联剂可能掩盖SCS的固有生物活性。系统研究SCS单独对伤口愈合的影响及其结构参数（分子量、硫含量、磺化位点）对再生机制的作用尚未开展，这代表了一个至今尚未探索的关键结构-功能关系。

传统的磺化策略，如使用氯磺酸-吡啶或SO?-吡啶复合物的方法（如基础综述中所述[11]），虽然有效，但存在显著缺点。这些方法通常涉及有毒试剂，导致替代模式不可控和聚合物降解，并对环境造成影响[3]，从而阻碍了精确的结构-活性研究。这些限制推动了寻找更环保的替代方案。在这种情况下，深共晶溶剂（DES）作为一种可持续的反应介质应运而生[12]。最近关于多糖磺化的综述，包括Berezhnaya等人的工作[13]，特别强调了基于DES的系统作为无毒和无腐蚀性的方法的前景。特别是基于磺胺酸（SA）-尿素的DES系统在有机合成、分离过程和天然聚合物的绿色磺化方面显示出了巨大潜力[14]。成功的应用包括桦木木聚糖硫酸盐[15]、磺化纤维素[16]、半乳甘露聚糖硫酸盐[17]和淀粉硫酸盐[18]的合成。尽管DES系统已偶尔用于CS的磺化[19]，但关于DES在CS磺化中控制6-O单取代、3,6-O双取代和2-N,3,6-O三取代模式方面的应用尚未探索。

在本研究中，我们采用了一种优化的绿色DES介导的系统来合成SCS。这种方法与传统方法不同，可以实现三种不同的取代模式（6-O、3,6-O和2-N,3,6-O）。通过傅里叶变换红外光谱（FTIR）、核磁共振（NMR）、元素分析、HPLC结合多角度激光散射仪和差示折射率检测器（HPSEC-MALLS-RI）以及ζ电位测量进行了全面表征。合成的SCS具有优异的水溶性，并通过温度控制实现了选择性位点修饰（图1A）。此外，SCS促进了L929成纤维细胞的迁移。首次使用小鼠的全厚度皮肤伤口模型来阐明磺化结构与伤口愈合性能之间的结构-活性关系。SCS通过增强伤口愈合早期的TGF-β1和VEGF分泌来促进血管生成，并刺激胶原沉积以重建细胞外基质（图1B）。这项工作为基于SCS的促进上皮化和细胞外基质重塑的制剂提供了理论基础，同时也为高活性肝素模拟生物材料提供了一种可持续的策略。

材料

中等分子量的CS（商品编号448877，CAS:9012-76-4，基于粘度的分子量为190,000–310,000 Da，脱乙酰度通过滴定确定为94.1%）购自Sigma-Aldrich。尿素（纯度≥99%）和SA（纯度≥99.5%）分别购自上海Macklin生化公司和Aladdin生化科技有限公司（中国）。用于定量检测小鼠转化生长因子-β1（TGF-β1）和血管内皮生长因子的商业酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒

壳聚糖硫酸盐的合成

原始CS的分子量（Mw）通过HPSEC-MALLS-RI测定为3.4 × 10⁵ Da。在SCS的合成中，使用了一种由尿素和SA组成的绿色DES系统。这种绿色合成策略采用无溶剂的一锅反应系统，并通过简单的温度和摩尔比调整来调节反应性。虽然尿素和SA的熔点分别为133°C和205°C，但它们的共晶混合物在远低于它们熔点的温度下形成液相

结论

本研究建立了一个基于DES的壳聚糖精确磺化平台。SA-尿素DES系统通过温度调节实现了可控的磺化模式，产生了特定的取代位点（6-O、3,6-O或2-N,3,6-O），并且硫含量可调（8.6–15.1 wt%）。该方法解决了传统方法的环境限制。合成的SCS表现出促进L929细胞迁移的能力。此外，通过系统研究各个效应

CRediT作者贡献声明

Jing Zhang：方法学、实验设计、数据分析、初稿撰写。 Yiming Chen：方法学、实验设计。 Wenya Meng：数据验证、数据分析。 Huifang Liu：数据可视化、验证、实验设计。 Long Yu：项目监督、项目管理、数据分析、概念构思、审稿与编辑。 Ping Dong：项目监督、项目管理、资金获取、概念构思、审稿与编辑。 Jing Li：审稿与编辑。

写作过程中生成式AI和AI辅助技术的声明

在准备本工作时，作者使用了Deepseek工具来改进手稿的语言。使用该工具后，作者根据需要审查和编辑了内容，并对发表文章的内容负全责。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

本工作得到了国家重点研发计划（项目编号2024YFD2100403）、山东省自然科学基金（项目编号ZR2024MC086）以及国家海洋食品加工与安全控制重点实验室开放基金（项目编号SKL202411）的支持。