《International Journal of Biological Macromolecules》：Neonatal Fc receptor (FcRn)-targeted design of protein nanocages for sustained circulation
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蛋白纳米笼通过基因融合新生儿Fc受体结合域（FBD）显著延长体内半衰期至34倍，系统优化了FBD类型、连接臂长度及铰链结构，确保高效合成与稳定释放，为纳米医学提供新型治疗平台。
作者：Yeram Lee、Dayeon Kang、Wonkyung Ahn、Sea Kwon、Yiluo Hu、Nayeon Kim、Yeju Go、Kwang-Hee Shin、Eun Jung Lee
韩国庆北国立大学化学工程与应用化学学院，大邱，41566
摘要
基于蛋白质的纳米笼具有独特的优势，包括高度有序且均匀的结构、高表面积与体积比、固有的生物降解性和生物相容性，以及易于进行化学和基因工程改造。尽管纳米医学领域取得了显著进展，但这类纳米载体的体内半衰期较短，这仍是其临床应用的主要障碍。在本研究中，我们通过将新生儿Fc受体结合域（FBDs）通过基因融合到蛋白质纳米笼表面，成功设计了具有显著改善药代动力学的纳米载体。这些经过改造的蛋白质纳米笼不仅实现了高产率，还具有较长的保质期稳定性。它们能够以pH依赖的方式与新生儿Fc受体结合，使其体内半衰期比野生型纳米笼延长了34倍。这些发现为增强基于蛋白质的纳米载体的系统循环能力提供了可行的策略，从而拓宽了它们作为下一代治疗平台的潜力。
引言
天然来源的纳米载体——包括细胞外囊泡、多糖纳米颗粒和蛋白质纳米笼——由于其优越的物理化学特性（如高表面积与体积比、可调节的大小和形态、表面功能化以及高效的封装能力，在纳米生物技术中具有重要地位[1]。此外，它们的生物相容性和生物降解性显著提高了其在纳米医学中的应用价值。
其中，蛋白质纳米笼因其通过蛋白质亚基自组装形成的精确有序的笼状结构而受到特别关注[2][3]。蛋白质纳米笼有三个主要的工程改造位点：内部、外部和亚基间界面，这为功能化提供了多种可能性[4]。内部可以改造以增强分子货物（包括药物、肽和成像剂）的封装、保护和释放[5][6][7]；外部可以通过高亲和力配体及功能分子进行修饰，以延长循环时间、提高细胞靶向性和逃避免疫系统[8][9][10]；亚基间界面在蛋白质纳米笼的自组装和解体过程中起着关键作用，可实现条件响应性的智能药物释放和精确调节的结构稳定性[11]。多种生物工程策略使得蛋白质纳米笼在药物递送、分子成像和纳米治疗剂开发中具有很高的应用价值。最近，计算蛋白质设计和结构预测方面的进展（这一成就获得了诺贝尔化学奖的认可）使得通过合理设计亚基间界面来从头设计新的蛋白质纳米笼成为可能[12][13][14][15]。这些进展有望进一步优化蛋白质纳米笼的生物工程特性，从而加速并扩展其应用范围。然而，蛋白质纳米笼通常具有较差的药代动力学特性，其体内半衰期仅几小时[16][17][18]，这严重限制了其临床转化和商业化。
为克服基于蛋白质的载体的体内稳定性不足和循环半衰期较短的问题，人们开发了多种策略来改善其药代动力学特性[19]。这些方法包括使用亲水性聚合物（如聚乙二醇（PEG）进行共价修饰[20][21][22][23]，与内在无序的多肽（如PAS和XTEN）融合[10][24][25]，以及结合天然来源的蛋白质片段（如白蛋白）或免疫球蛋白G（IgG）的可结晶片段（Fc）[26][27]。其中，PEG化是最成熟的方法，它可以增加纳米载体的流体动力学尺寸，从而减少肾脏清除和蛋白酶降解。然而，PEG化可能会引入分子异质性、免疫原性和生物累积等问题[21][28][29][30]。因此，人们一直在寻找更安全、更有效的替代方法。
与内在无序的多肽（IDPs）（如XTEN或PAS序列）的融合已成为一种替代方案。这些亲水IDPs可以在细菌中共同表达，并已被证明可将纳米载体的体内半衰期延长至野生型纳米笼的十倍[10]。然而，尽管这些重复序列具有功能优势，但它们可能引发免疫反应，并且细菌表达效率较低[31][32]。另一种有效延长蛋白质循环时间的方法是将蛋白质与IgG的Fc结构域、白蛋白或能够结合血清白蛋白的肽进行基因融合[17][26][27]。Fc结构域已被广泛用于通过新生儿Fc受体（FcRn）介导的内吞作用来延长治疗性蛋白质的半衰期[33]。但在蛋白质纳米笼的应用中，其使用主要侧重于利用抗体依赖的细胞毒性（ADCC）而非改善药代动力学。
在本研究中，我们通过在蛋白质纳米笼表面展示IgG的Fc结构域来延长其体内半衰期。鉴于蛋白质纳米笼本身具有多价结合能力，我们研究了全长Fc结构域以及最小化的FcRn结合结构，特别是CH2结构域和工程化的affibody Z。这些结构统称为FcRn结合域（FBD）。为此，我们通过将FBDs基因连接到蛋白质纳米笼上，制备了FBD融合的蛋白质纳米笼（FFPNs），从而实现了FBDs在纳米笼表面的有序多价展示。除了FBD的类型外，我们还系统地考察了FBD与纳米笼之间的连接长度、FBD内部是否存在铰链区域等因素，评估了这些因素对大肠杆菌中的产率、溶解性、结构稳定性以及pH依赖的FcRn结合动力学的影响。基于这些结果，我们评估了四种候选纳米载体在小鼠模型中延长体内半衰期的潜力。
FFPNs的合成
为了制备FBD系列，我们使用适当的引物通过聚合酶链反应（PCR）扩增了五个基因克隆。wtFc和Z的合成基因由Cosmo Genetech（韩国）提供，wtFc作为PCR模板用于扩增hxFc、hCH2和hxCH2。(1) N-XhoI-(wtFc)-HindIII-C；(2) N-XhoI-(hxFc)-HindIII-C；(3) N-XhoI-(hCH2)-HindIII-C；(4) N-XhoI-(hxCH2)-HindIII-C；(5) N-XhoI-(Z)-HindIII-C。
为了制备FFPNs，我们使用了上述五个基因
FBD融合蛋白质纳米笼（FFPNs）的合理设计
作为模型纳米载体，我们选择了人铁蛋白纳米笼。铁蛋白由24个单体自组装而成，形成一个内部直径约为8纳米、外部直径约为12纳米的球形中空壳。与其他蛋白质纳米笼相比，铁蛋白具有更强的结构稳定性，在极高温度（约72°C）和广泛的pH范围（4–9）下仍能保持结构，并且免疫原性较低，因此适用于多种应用
结论
基于蛋白质的纳米笼因其优越的特性（如精确有序的结构和广泛的生物工程潜力）而成为生物医学应用中的有前景的平台。特别是，它们能够在纳米笼表面高效展示配体（尤其是抗原表位），从而推动了多种基于纳米笼的治疗剂的发展，其中一些已进入临床试验阶段，例如预防性疫苗等
CRediT作者贡献声明
Yeram Lee：撰写 – 审稿与编辑、撰写 – 原稿、可视化、研究、数据分析。
Dayeon Kang：撰写 – 原稿、可视化、研究、概念构思。
Wonkyung Ahn：撰写 – 审稿与编辑、研究。
Sea Kwon：撰写 – 审稿与编辑、研究。
Yiluo Hu：撰写 – 审稿与编辑、可视化。
Nayeon Kim：研究。
Yeju Go：研究。
Kwang-Hee Shin：验证、数据分析。
Eun Jung Lee：撰写 – 审稿与
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本手稿的研究工作。
致谢
本工作得到了韩国政府（MSIT）资助的国家研究基金会（NRF）（项目编号：RS-2023-00218812和RS-2025-00558801）以及韩国气候、能源与环境部（MCEE）资助的韩国能源技术评估与规划研究所（KETEP）（项目编号：RS-2022-KP002719）的资助。
