《International Journal of Biological Macromolecules》：Structure-based design of pyrazole derivatives targeting the human Cyclophilin D binding site
编辑推荐：
线粒体通透性转换孔（MPTP）调控异常与多种疾病相关，环孢素D（CypD）是关键调节蛋白。本研究通过FragInc策略重新评估52个低亲和力片段，利用双突变体K125Q;K133I和晶体学技术揭示S3口袋（位于S1'和S2之间），并合成四类同时靶向S3和S2的新分子，为高选择性CypD抑制剂设计提供新思路。
Diana O. Silva | Micael C. Freitas | Catarina F. Malta | Madalena T. Martins | Pedro M.F. Sousa | Pedro M. Matias | Daniel Schwarz | M. Rita Ventura | Ulrich Gr?dler | Tiago M. Bandeiras
iBET，实验与技术生物学研究所，邮政信箱12，2781-901，奥埃拉斯，葡萄牙
摘要
线粒体通透性转换孔（MPTP）的失调与多种人类疾病相关，包括多发性硬化症、心血管疾病和神经系统疾病。人类环孢素D（Cyclophilin D）是一种已知的MPTP调节因子，尽管它没有深层次的结合位点，但人们认为可以针对它来开发具有临床应用价值的候选药物。基于片段的药物发现方法是针对这类靶点的一种强大工具。我们重新研究了通过X射线晶体学分析得到的52个片段 hit，这些片段在之前的筛选中未能确定其结构。利用两种CypD突变体，结合共结晶和浸泡技术（FragInc方法），我们获得了新的高分辨率CypD-片段复合物晶体结构。我们发现了一个吡唑[1,5-a]嘧啶-2(1H)-酮片段能够结合到CypD的S1'和S2口袋之间的空隙中。这些结构发现指导了我们合成四种新分子，旨在同时作用于新的吡唑结合口袋和S2位点，并测定了这些分子与CypD复合物的晶体结构。这项工作为基于结构的新型三向抑制剂设计开辟了新的前景，这些抑制剂针对的是人类CypD，并提出了一种利用多种技术手段来研究低亲和力片段的方法。
引言
线粒体功能障碍和MPTP（线粒体通透性转换孔）的失调已被证明与一系列细胞过程有关，这些过程会导致多种疾病，如多发性硬化症、神经系统疾病和心血管疾病[1]、[2]、[3]。MPTP是一种非特异性的通道，用于线粒体基质与细胞质之间的信号传递或物质转移[4]，在维持Ca2+稳态、调节氧化应激信号和蛋白质转运中起着核心作用[5]。尽管其精确的分子组成仍存在争议，但普遍认为MPTP是由多种线粒体蛋白共同作用形成的，包括环孢素D（CypD）、腺嘌呤核苷酸转运蛋白（ANT）、电压依赖性阴离子通道（VDAC）和磷酸载体（PiC），越来越多的证据表明线粒体F?F?（F）-ATP合酶也是其形成的关键因素[6]、[7]。MPTP的开放程度还受到活性氧、线粒体钙负荷和细胞能量状态等因素的影响。短暂的MPTP开放可能有助于某些生理功能，如线粒体生物能的变化和快速的Ca2+外流，而长时间的MPTP开放则会导致膜电位丧失、线粒体功能障碍，最终通过凋亡或坏死途径导致细胞死亡，这表明MPTP是一个有吸引力但具有挑战性的治疗靶点[6]、[7]。尽管具有治疗潜力，但目前可用的药物受脱靶效应和低治疗效果的限制[8]、[9]，因此迫切需要识别和开发新的抑制剂。
环孢素D（CypD）是一种22 kDa的人类蛋白质，存在于线粒体基质中，被广泛认为是调节MPTP形成和开放的关键因子[10]。通过药理学抑制或基因敲除CypD的酶活性可以使该孔变得不敏感，从而降低孔开放的概率并增加线粒体对Ca2+的耐受性。CypD属于环孢素蛋白家族，这类蛋白属于肽基脯氨酸顺反异构酶（PPIases），能够催化脯氨酸的顺反异构化。PPIases在许多蛋白质的激活或降解过程中起到调节作用，并影响蛋白质的折叠和细胞运输[11]。环孢素在病理生理过程中发挥着重要作用，如炎症、血管功能障碍、伤口愈合、先天性HIV免疫、HIV感染、宿主-寄生虫相互作用和肿瘤生物学[12]。
虽然许多化合物可以通过不同的化学结构激活或阻断MPTP，但其中最值得注意的调节剂可能是环孢素A（CsA）（图1）。CsA是一种由11个氨基酸组成的环状肽，是一种非选择性的环孢素抑制剂[13]。CsA以纳摩尔级的亲和力与所有环孢素结合，但由于其选择性较低，可能会引起广泛的不良反应。此外，CsA具有免疫抑制作用，但水溶性低、生物利用度差且血脑屏障通透性低，这严重限制了其临床应用[14]。针对CypD的抑制剂设计通常针对其结构明确的、结合口袋较浅的区域，该口袋由两个相邻的S1’和S2口袋组成[15]。S1’口袋也被称为脯氨酸相互作用口袋[16]，由催化性的Arg55以及高度保守的疏水性、极性和芳香族残基组成[15]。S2口袋表面有一组控制口袋访问和可用性的残基，可能影响底物的结合特异性[17]。由于S2口袋能够容纳苯胺取代基，因此也被称为苯胺口袋[18]。
了解化合物与目标蛋白的结合模式对于开发高选择性的抑制剂至关重要。由于野生型的人类环孢素D蛋白难以结晶，因此成功使用了CypD突变体来建立稳定的结晶系统。2005年，通过蛋白质工程改造CypD的K133I突变体，获得了高对称性的晶体（SG P41212），这种晶体结构使用野生型蛋白是无法获得的[19]。2016年，通过对CypD双突变体（K125Q; K133I）与配体的共结晶研究，获得了能够自由接触底物口袋的晶体结构[20]。除了工程改造的点突变外，用于结构研究的可结晶CypD构建体还经过了N端截短处理。这种截短是常规操作，因为CypD的N端区域非常灵活且无序，这会干扰高质量X射线衍射所需的有序晶格形成。因此，所有现有的CypD晶体结构都依赖于缺乏天然N端片段的构建体，这限制了基于晶体学的方法的应用。虽然前29个残基构成了线粒体靶向序列，但随后通过有限蛋白酶切割去除的13个残基（据报道这些残基在F-ATP合酶OSCP亚基结合中起调节作用[21]）也为构象灵活性做出了贡献。它们的去除对于生成适合结晶的CypD变体至关重要。
尽管进行了多次药物发现尝试，但仍然缺乏具有药物特性的选择性强且细胞活性高的CypD抑制剂。少数非肽类CypD结合分子（包括尿素衍生物）在体外显示出PPIase抑制和抗病毒活性[17]。最近，通过片段筛选和药物化学优化，发现了一些新的CypD抑制剂，但这些抑制剂在细胞中的活性不足（图1）。在这项研究中，仅使用CypD K133I突变体通过表面等离子体共振（SPR）确认的58个结合片段中的6个成功解析出了CypD-片段复合物结构[18]。
在本研究中，我们采用了多种片段孵育方法，扩展了X射线晶体学的应用范围，以获得片段结合模式的结构信息（称为FragInc），重新研究了剩余的52个片段，并获得了新的CypD-片段复合物结构。除了CypD K133I突变体外，我们还使用了最近发现的K125Q;K133I CypD突变体，该突变体的晶体结构使得口袋易于访问。新的CypD-片段复合物晶体结构的获得进一步扩展了我们对CypD片段结合机制的理解。其中，我们发现了一个吡唑[1,5-a]嘧啶-2(1H)-酮片段能够结合到CypD中一个未被探索的口袋（命名为S3口袋），该口袋位于S1’和S2口袋之间。基于CypD-配体晶体结构，我们合成了四种新分子，同时作用于吡唑口袋和S2口袋。探索这三个口袋的组合可能为开发更有效和选择性的CypD抑制剂提供新的设计策略。
His6-hsCypD (43-207)-Avi蛋白的表达与纯化
将编码人类环孢素D（CypD）的氨基酸43至207的序列克隆到pRSF-Duet?-1的多克隆位点中，在N端添加His6标签（可通过Tobacco Etch Virus蛋白酶（AcTEV）切割），在C端添加AviTag（GLNDIFEAQKIEWHE），从而得到His6-TEV-hsCypD (43-207)-AviTag构建体。BL21(DE3)大肠杆菌细胞被转入含有His-TEV-CypD (43-207)-AviTag的质粒，并在含有...
用于FragInc方法的CypD突变体的正交SPR结合验证和功能表征
为了评估新的CypD突变体是否适合用于我们FragInc方法中剩余52个片段的结晶，我们通过SPR进行了结合确认。正如预期的那样，所有52个片段在SPR中的结合强度都很弱，但与CypD野生型及突变体（K133I和K125Q; K133I）的KDss值相似（表S1）。我们还使用1H NMR光谱评估了所有CypD变体的PPIase活性...
结论
本研究证明了FragInc协议在扩展基于片段的药物发现（FBDD）中蛋白质-片段复合物晶体结构数量方面的有效性。在FBDD过程中，理解分子结合模式对于指导片段优化至关重要。然而，蛋白质-片段复合物的结晶常常受到片段亲和力低和溶解度有限的挑战。
FragInc策略通过系统地应用五种平行方法来克服这些限制...
CRediT作者贡献声明
Diana O. Silva：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原始草稿，实验研究，数据管理，概念构思。Micael C. Freitas：实验研究。Catarina F. Malta：实验研究。Madalena T. Martins：实验研究。Pedro M.F. Sousa：撰写 – 审稿与编辑，实验研究，撰写 – 原始草稿，实验研究，概念构思。Daniel Schwarz：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原始草稿，实验研究。M. Rita Ventura：撰写
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢
本工作得到了葡萄牙科学技术与高等教育部（FCT/MCTES）通过国家资金的支持，资助项目包括iNOVA4Health（UIDB/04462/2020和UIDP/04462/2020）、MOSTMICRO-ITQB研发单元（UIDB/04612/2020, UIDP/04612/2020）以及附属实验室LS4FUTURE（LA/P/0087/2020）。NMR数据是在葡萄牙奥埃拉斯的CERMAX（ITQB-NOVA）获得的，所用设备由FCT资助，项目编号为AAC 01/SAICT/2016。
