《International Journal of Biological Macromolecules》：Dual functionalization of chitosan/DNA complexes with mannose and hydroxyl-rich acids for enhanced gene delivery efficiency
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为解决DNA疫苗转染效率低、易降解的难题，本研究创新性地将壳聚糖与甘露糖（靶向抗原呈递细胞）及葡萄糖酸/乳糖酸（促进DNA解离）进行双功能化修饰，构建了一种新型基因递送系统。实验表明，该双修饰聚复合物显著提升了体外转染效率，并能有效靶向并激活巨噬细胞和树突状细胞，诱导Th1极化免疫反应，为开发高效的黏膜疫苗佐剂提供了新策略。
新发与再现人畜共患病毒，如埃博拉、寨卡和新冠病毒（如SARS-CoV-2）的频发，凸显了开发快速、适应性强的疫苗策略的紧迫性。DNA疫苗以其安全性好、稳定性高、设计灵活等优点，成为一种极具前景的平台。然而，其临床应用却长期受到两大“拦路虎”的制约：一是转染效率低下，遗传物质难以高效进入目标细胞；二是裸露的DNA在体内极易被快速降解。这两个挑战在黏膜免疫接种中尤为突出，因为黏膜表面复杂的屏障和酶环境使得有效递送难上加难。那么，能否设计一种“智能”的递送载体，既能保护DNA“翻山越岭”，又能精准将其投递到免疫系统的“司令部”——抗原呈递细胞（Antigen-Presenting Cells, APC）中，并成功释放以激活强大的免疫反应呢？
壳聚糖，一种从甲壳素中提取的天然阳离子多糖，因其良好的生物相容性、生物可降解性和易于修饰的特性，被视为有潜力的非病毒基因递送载体。它像一块“天然磁石”，能通过静电作用与带负电的核酸紧密结合，形成稳定的聚复合物（polyplexes），为其提供保护。然而，传统壳聚糖载体也存在明显短板：它与DNA的结合有时“过于牢固”，导致进入细胞后DNA难以有效解离释放；同时，它缺乏“导航”能力，无法精准靶向那些负责启动免疫应答的关键细胞——如树突状细胞（Dendritic Cells, DCs）和巨噬细胞。
面对这些挑战，来自葡萄牙科英布拉大学的研究团队在《International Journal of Biological Macromolecules》上发表了一项创新研究。他们构思了一个“一箭双雕”的策略：对壳聚糖进行双功能化修饰。一方面，接上甘露糖（Mannose, MAN）作为“导航头”，使其能够被APC表面高表达的甘露糖受体（Mannose Receptor, MR）识别，从而实现靶向递送。另一方面，引入富含羟基的分子，如葡萄糖酸（Gluconic Acid, GA）或乳糖酸（Lactobionic Acid, LA），作为“释放开关”。这些羟基的引入旨在调节壳聚糖的电荷密度，削弱其与DNA之间的静电相互作用，从而促进DNA在细胞内的解离，提高基因表达效率。通过这种精巧的设计，他们期望开发出一种能高效转染、选择性靶向APC、并能有效激活免疫应答的壳聚糖基黏膜疫苗佐剂系统。
为验证这一设想，研究人员开展了一系列严谨的实验。他们首先通过化学方法成功合成了不同修饰程度的甘露糖化壳聚糖（CHIT:MAN）和葡萄糖酸化壳聚糖（CHIT:GA）。利用核磁共振氢谱（1H NMR）、傅里叶变换红外光谱（FTIR）和茚三酮法对其化学结构、脱乙酰度（DDA）和游离氨基数量进行了详尽的表征，证实了修饰的成功。随后，将这些功能化聚合物与编码荧光素酶的质粒DNA（pDNA）混合，制备了多种不同配比的双功能化壳聚糖/DNA聚复合物，例如CL-MAN（LA与MAN组合）和CGA-MAN（GA与MAN组合）。他们系统地表征了这些聚复合物的理化性质（如粒径、zeta电位、形貌）、DNA结合与保护能力、pH依赖性稳定性以及甘露糖靶向性。
在生物学功能评估上，研究分为几个层次：首先，在A549人肺腺癌细胞系中评估聚复合物的细胞毒性和转染效率，筛选最优配方。其次，在RAW 264.7小鼠巨噬细胞系中，通过竞争抑制实验验证甘露糖介导的细胞摄取，并检测聚复合物刺激产生的炎症介质，如一氧化氮（NO）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-6（IL-6）。最后，也是最具说服力的一环，是在人原代单核细胞来源的树突状细胞（moDCs）模型中，评估聚复合物对DC成熟（表面标志物CD40、CD80、CD86、HLA-DR表达）和细胞因子分泌谱（TNF-α、IL-12、IL-6、IL-10）的影响，从而判断其诱导免疫应答类型的能力。moDCs来源于健康捐献者外周血单核细胞（PBMCs）。
研究结果显示：
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双功能化修饰成功并影响性质：光谱学数据确证了壳聚糖与甘露糖（通过还原胺化）及葡萄糖酸（通过碳二亚胺介导的偶联）的成功共价连接。修饰降低了壳聚糖的脱乙酰度和游离氨基数量，葡萄糖酸的修饰程度高于甘露糖。细胞毒性实验表明，在测试浓度下，多数功能化聚合物及最终聚复合物保持良好的生物相容性。
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GA的引入显著提升转染效率：在A549细胞中的转染实验表明，单纯甘露糖化壳聚糖转染效率不佳，而与GA或LA组合后效率大幅提升。其中，CGA-MAN 0.3-0.7（GA:MAN = 0.3:0.7）和CL-MAN 0.9-0.1（LA:MAN = 0.9:0.1）两种双修饰聚复合物表现出最高的荧光素酶基因表达水平，甚至优于常用阳性对照聚乙烯亚胺（PEI），且细胞毒性显著低于PEI。
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聚复合物具备良好的理化特性与靶向性：聚复合物在生理相关培养基中粒径保持相对稳定，能完全结合并保护DNA免受DNase I降解。糖识别实验证实了聚复合物表面甘露糖残基的存在及其与伴刀豆球蛋白A（ConA）的特异性结合。
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有效激活固有免疫细胞：
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在巨噬细胞中：CGA-MAN 0.3-0.7和CL-MAN 0.9-0.1能显著刺激RAW 264.7细胞产生TNF-α和NO，表明其具有激活巨噬细胞的潜力。
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在树突状细胞中：研究取得了关键性发现。甘露糖靶向的聚复合物（CGA-MAN 0.3-0.7和CL-MAN 0.9-0.1）能有效促进人moDCs的成熟，表现为共刺激分子（CD40、CD80、CD86）和主要组织相容性复合体（MHC）分子（HLA-DR、HLA-ABC）表达的上调。更重要的是，它们刺激DC产生了高水平的Th1型特征性促炎细胞因子（TNF-α和IL-12），同时并不诱导抗炎细胞因子IL-10的分泌。这种细胞因子分泌谱（高IL-12、无IL-10）对于驱动有利于清除细胞内病原体（如病毒）的Th1型免疫反应至关重要。
结论与意义：本研究成功设计并构建了一种基于壳聚糖的双功能化基因递送系统。该系统创新性地将靶向单元（甘露糖）与调控释放单元（葡萄糖酸/乳糖酸）整合于一体，巧妙地解决了DNA疫苗递送中靶向性不足和细胞内释放效率低的共性问题。实验结果表明，最优化的双修饰聚复合物（特别是CGA-MAN 0.3-0.7和CL-MAN 0.9-0.1）不仅能实现高效基因转染，还能通过甘露糖受体介导的途径被APC有效摄取。尤为重要的是，它们能精确调控免疫应答，在有效激活DCs、促进其成熟的同时，诱导出偏向Th1型的细胞因子环境，而这正是许多抗病毒疫苗所期望的理想免疫反应类型。
该工作的重要意义在于：第一，策略创新：首次报道了利用葡萄糖酸修饰壳聚糖用于疫苗目的，并通过双功能化协同增效，为聚合物基因载体设计提供了新思路。第二，功能验证全面：从材料表征、体外转染到免疫细胞激活，特别是在人原代DCs模型中的验证，为后续应用提供了扎实的实验依据。第三，应用前景明确：所开发的系统兼具高效递送、靶向识别和免疫调节功能，展现出作为新型黏膜疫苗佐剂的强大潜力，为应对快速出现的传染性疾病（如COVID-19）提供了一种有前景的疫苗开发平台。这项研究为下一代非病毒基因疫苗和免疫治疗制剂的发展提供了有价值的参考。
