《International Journal of Biological Macromolecules》：Bioprocess engineering as a tool to modulate the rheological performance of
Ensifer meliloti SEMIA 135 exopolysaccharide
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本研究聚焦微生物胞外多糖（EPS）工业化应用中的关键瓶颈——如何理性设计并预测性调控其功能。为解决生物反应器培养条件与最终聚合物性能间关联不明的“黑箱”问题，研究人员系统探究了通气与搅拌对苜蓿中华根瘤菌（Ensifer meliloti）SEMIA 135 EPS的糖组成、电荷密度及其流变性能的交互影响。结果表明，调控培养条件可显著改变聚合物结构（如糖醛酸含量2.91%–11.96%）与宏观粘度（68.7–228.3?Pa·s），并建立了“培养条件-结构-流变性能”的定量预测框架。该工作为实现功能导向的微生物生物材料理性设计与可控制备提供了新策略。
在食品、化妆品、医药等领域，对具有特定、可预测流变行为的亲水胶体需求日益增长。这些高分子聚合物对于控制产品质地、稳定性和加工性至关重要。与此同时，市场对可再生、可生物降解的合成聚合物替代品的需求，也推动了对微生物生物聚合物的研究。其中，微生物胞外多糖（EPS）因其结构的多样性、生物相容性以及通过生物过程工程调控其性能的潜力而备受关注。EPS是由细菌、酵母和真菌分泌的高分子量聚合物，其复杂的化学结构（常包含多种中性糖、氨基糖和糖醛酸）决定了其精密的流变行为，从而定义了其功能潜力。微生物EPS相比植物或藻类来源同类产品的关键优势在于其生产：它们可以在受控的生物反应器中合成，这为调整其最终组成提供了独特途径。这种“生物工厂”方法为理性设计具有定制性能的流变改性剂提供了机会。
然而，文献中存在一个持续的空白：对上游生物过程条件如何影响这些聚合物的最终分子结构和性能缺乏系统性的理解。大多数研究传统上是孤立的，要么只关注优化培养产量，要么只关注所获聚合物的流变学表征，很少建立生物反应器环境与材料功能之间的关键定量联系。这种生物过程、结构和功能之间的脱节，阻碍了具有预定特性的EPS的理性设计，并限制了其在工业中的更广泛应用。
这项研究直接解决了这一空白，验证了利用受控生物过程条件来“定制”EPS流变性能的可行性。具体而言，研究团队系统评估了通气和搅拌对苜蓿中华根瘤菌（Ensifer meliloti）SEMIA 135 EPS单糖组成和电荷密度的交互效应，建立了生物过程变量、聚合物化学组成与其最终宏观粘弹性响应之间的直接定量关联，并全面表征了聚合物在不同pH、浓度和温度条件下的物理稳定性和触变行为。通过实现这些目标，该工作建立了一个连接培养流体力学与最终材料功能的定量框架，展示了一种可扩展的生产具有目标流变谱的生物聚合物的策略。相关研究成果发表于《International Journal of Biological Macromolecules》。
研究人员采用了多种关键技术方法来系统探索培养条件对EPS结构及性能的影响。首先，实验设计是关键，他们使用了中心复合可旋转设计（CCRD） 来系统改变通气（0.8–2.2 vvm）和搅拌（59–341?rpm） 两个关键生物反应器参数，共产生11个不同的EPS样品用于后续分析。其次，在化学结构表征方面，对11个EPS样品进行了酸水解，并利用高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测法（HPAEC-PAD） 精确鉴定和定量了其单糖组成，包括多种中性糖和糖醛酸。最后，在功能性能评估中，流变学表征是核心。他们使用旋转流变仪，通过稳态剪切测试、振荡频率扫描、振幅扫描、温度扫描以及触变/恢复测试等一系列方法，全面评估了EPS溶液在不同剪切速率、频率、温度、pH和浓度下的表观粘度、储能模量（G′）、损耗模量（G″） 等流变学参数，并利用Carreau-Yasuda模型对流动曲线进行了拟合，以获取零剪切粘度等关键参数。此外，统计分析方法如方差分析（ANOVA） 和皮尔逊相关性分析被用于量化培养条件的影响并建立变量间的关联。
3.1. 碳水化合物分析
对11个CCRD实验获得的EPS样品进行单糖组成分析。结果表明，该菌株产生的生物聚合物是复杂且组成可变的杂多糖，主要由葡萄糖（56.15–79.87%）和半乳糖（12.96–16.45%） 构成，并含有赋予其阴离子特性的糖醛酸（半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸），其总含量在2.91%到11.96%之间变化。分析显示，培养条件（通气和搅拌）不仅改变了主要糖的比例，还影响了次要糖的掺入，证明了微生物生物合成途径对氧气可用性和流体动力学应力的敏感性。例如，在低通气高搅拌条件下（EPS/EM-3）获得的样品显示出最多样化的组成，含有高水平的次要糖和独特的甘露糖及核糖检出，表明存在由联合应激诱导的显著代谢转变。
3.2. 流变学性质
3.2.1. 培养条件的影响
所有EPS溶液（1.0 wt%）均表现出强烈的剪切稀化（伪塑性） 行为。然而，绝对粘度因培养条件不同而差异显著。表观粘度在0.01 s-1剪切率下从68.7 Pa·s（EPS/EM-4）到228.3 Pa·s（EPS/EM-3）不等。通过响应面法（RSM） 分析发现，通气与搅拌之间存在强烈的交互作用，对粘度影响最大。在低通气高搅拌条件下获得最高粘度，而在高通气高搅拌条件下获得最低粘度。振荡频率扫描显示，所有样品的储能模量（G′）在整个频率范围内均高于损耗模量（G″），表现出以弹性为主的弱凝胶行为，但粘弹性响应的性质受生产参数调节。皮尔逊相关性分析 进一步揭示，粘度与半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸含量呈显著正相关，而与葡萄糖含量呈显著负相关，证实了聚合物的电荷密度是决定其粘度的主要因素。糖醛酸通过其去质子化的羧基产生静电斥力，使聚合物链扩张，增加流体力学体积和流动阻力。
3.2.2. 浓度的影响
对EPS/EM-4样品的详细研究表明，溶液粘度随聚合物浓度增加而急剧上升。在低浓度区，特定零剪切粘度与浓度呈线性关系，为稀溶液区。在重叠浓度（c≈ 1.35 g L-1） 以上，依赖性转变为陡峭的幂律关系，标志着进入了半稀缠结区，此时聚合物链开始重叠和相互贯穿，形成瞬态网络。粘弹性测试显示，随着浓度从0.01 wt%增加到3.0 wt%，体系行为从以粘性为主（G″ > G′）过渡到以弹性为主的凝胶态（G′ > G″，且模量对频率依赖性减弱）。Cox-Merz规则 在所有浓度下均失效，即复数粘度（η）在振荡测试中系统性地高于稳态剪切下的表观粘度（η）。这明确表明该EPS溶液不是简单的缠结聚合物溶液，而是形成了缔合网络**，其结构在小振幅振荡应变下保持完整，但在连续剪切流动中被破坏。
3.2.3. pH的影响
在pH 3–9范围内，EPS/EM-4溶液（1 wt%）均保持伪塑性行为和G′ > G″的弱凝胶网络。然而，粘度表现出明显的pH依赖性，在近中性pH时粘度最低，在酸性和碱性极端时粘度升高。在碱性条件下，糖醛酸的羧基完全去质子化，链上负电荷密度最大，链内静电斥力使链构象扩张，导致粘度和凝胶强度增加。在酸性条件下，虽然质子化减少了静电斥力，但氢键成为链间的主要作用力，促进了更致密、结构化网络的形成，同样导致粘弹性增加。
3.2.4. 温度的影响
EPS/EM-4溶液（1 wt%）的表现粘度随温度升高而下降，但伪塑性特征得以保留。温度扫描测试显示，粘度在约70°C附近发生急剧下降，标志着发生了热诱导的凝胶-溶胶转变。冷却过程中，粘度部分恢复但未回到初始值，表现出明显的热滞后和不可逆性，表明热诱导的网络解组装在实验时间尺度内无法完全可逆地重建。粘弹性频率扫描和温度扫描（1 Hz）结果支持了这一结论，显示在加热至约70°C时G′和G″相交，冷却后模量虽回升但显著低于初始值，网络重组动力学缓慢且形成较弱的结构。
3.2.5. 时间依赖性行为
触变环测试 和三步结构恢复测试 证实了EPS/EM-4溶液具有触变性，即其结构在剪切作用下破坏，静置后可随时间部分恢复。这表明该材料具有时间依赖的剪切稀化和恢复特性，适用于需要暂时降低粘度以利于加工（如泵送、涂抹），之后又能恢复原有稠度的应用。
本研究通过系统的实验设计和多尺度表征，成功地将生物反应器中的流体力学条件（通气和搅拌）与苜蓿中华根瘤菌SEMIA 135胞外多糖的最终化学结构及宏观流变性能建立了定量关联。研究证实，培养条件并非中性参数，而是强大的“代谢触发器”，能够调控EPS的单糖组成，特别是糖醛酸（电荷载体）的含量。糖醛酸含量是决定EPS溶液粘度的最关键结构因素，其变化与表观粘度强相关。低通气高搅拌的应激条件倾向于产生高电荷密度、高粘度的聚合物，形成更稳固的弱凝胶网络；而高通气高搅拌条件则导向更简单、葡萄糖比例高、粘度较低的聚合物。
该EPS展现出优异的伪塑性、触变性和粘弹性，能在较低浓度下形成以弹性为主的弱凝胶，且其行为显著依赖于浓度、pH和温度。特别值得注意的是，其流变行为在所有测试条件下均明显偏离Cox-Merz规则，强烈暗示其内部存在缔合网络结构，而非简单的缠结链。这种结构化流体的特性使其有望成为高性能的流变改性剂。
此项工作的核心意义在于，它超越了传统的试错法优化，建立了一个“生物过程条件—聚合物结构—材料功能”的理性设计框架。它证明了生物过程工程可以作为一种预测性工具，用于“定制”细菌多糖的分子结构和流变性能。这为开发具有目标功能（如特定粘度、凝胶强度、剪切稀化程度、pH/温度响应性）的新型可再生生物材料铺平了道路，并为其在食品、化妆品、制药和生物医学等需要精密控制流变行为的工业领域中的广泛应用提供了坚实的技术基础和设计原则。
