抑制电压依赖性阴离子通道1的聚集可以保护胰腺β细胞的线粒体免受葡萄糖的毒性损害

《International Journal of Biological Macromolecules》：Inhibition of voltage-dependent anion channel 1 aggregation protects pancreatic beta-cell mitochondria from glucose toxicity

葡萄糖毒性通过上调VDAC1表达并促进其病理多聚化，导致β细胞代谢紊乱和线粒体功能障碍，选择性抑制剂VBIT-4可逆转上述病理过程并稳定VDAC1构象。

　　

姚晨光|曾新宇|黄思远|程宏昌|黄慧中|邹子毅|牟波|马哈茂德·优素福|刘梅|魏艳红|刘金标|李汉珞|熊青|尚晓珂

湖北工业大学工业微生物学重点实验室心血管动力学与辅助技术组，工业发酵协同创新中心（教育部与湖北省共建），发酵工程重点实验室（教育部），国家“111”细胞调控与分子药学中心，武汉，430068，湖北省，中国

摘要

电压依赖性阴离子通道1（VDAC1）是位于线粒体外膜的主要孔形成蛋白，在调节线粒体代谢、氧化还原平衡和细胞凋亡中起关键作用。然而，其在糖尿病进展过程中对葡萄糖毒性诱导的胰腺β细胞功能障碍的具体贡献尚未完全明确。在本研究中，我们发现长期高葡萄糖暴露显著破坏了β细胞的代谢平衡，表现为葡萄糖利用增加、乳酸生成增多以及线粒体呼吸抑制。这些代谢紊乱伴随着线粒体碎片化、线粒体膜电位下降、ATP耗竭和活性氧（ROS）过度积累。值得注意的是，高葡萄糖处理显著上调了VDAC1的表达并促进了其病理性寡聚化。即使在正常血糖条件下，强制过表达VDAC1也足以诱导线粒体功能障碍和β细胞损伤，这支持VDAC1在葡萄糖毒性应激中的致病作用。使用选择性小分子抑制剂VBIT-4抑制VDAC1可显著缓解葡萄糖毒性引起的线粒体损伤，恢复ATP生成，减少ROS积累，保持线粒体膜电位，并提高野生型和VDAC1过表达β细胞的存活率。结合生物层干涉测量（BLI）、分子对接和分子动力学模拟，我们的数据表明VBIT-4与VDAC1之间存在直接结合相互作用，该相互作用导致VDAC1的β-桶结构发生构象变化，从而使其保持非寡聚化状态。总之，本研究确定VDAC1过表达和寡聚化是葡萄糖毒性诱导的线粒体功能障碍和β细胞损伤的关键介质，并强调了VBIT-4作为一种潜在的线粒体靶向策略，通过阻断VDAC1的病理性寡聚化来保护糖尿病中的β细胞功能。

引言

糖尿病（DM）是一种以持续高血糖为特征的慢性代谢性疾病，已成为全球主要的公共卫生负担[1]。流行病学数据显示，2型糖尿病（T2DM）占所有糖尿病病例的90%以上，其发展主要由胰岛素抵抗和胰腺β细胞进行性功能障碍共同驱动。尽管胰岛素抵抗通常先于高血糖的发生，但β细胞无法补偿日益增加的代谢需求是标志着从代偿性胰岛素抵抗向显性糖尿病转变的关键事件[2]，[3]。因此，保护β细胞功能已成为糖尿病预防和治疗策略的核心目标。长期暴露于高葡萄糖水平（通常称为葡萄糖毒性）是糖尿病过程中β细胞功能障碍的主要诱因[4]。持续的高血糖会破坏β细胞的代谢平衡，加剧氧化应激，并引发线粒体功能障碍，最终导致胰岛素分泌受损和β细胞凋亡增加[5]。

与其他许多细胞类型不同，胰腺β细胞严重依赖线粒体氧化代谢来将葡萄糖感应与胰岛素分泌联系起来[6]。此外，它们的抗氧化能力相对较低，在代谢应激下特别容易受到氧化损伤[7]。葡萄糖刺激的胰岛素分泌还依赖于线粒体氧化磷酸化生成ATP，从而触发质膜去极化和钙内流[8]，[9]。因此，线粒体生物能量的紊乱直接损害了胰岛素分泌能力。此外，线粒体在调节氧化还原平衡、钙稳态和凋亡信号传导中起着关键作用，进一步凸显了它们在维持β细胞完整性中的重要性。越来越多的证据表明，线粒体结构和功能的改变通常先于不可逆的β细胞丢失，这是糖尿病发病机制的早期事件。线粒体外膜是连接线粒体代谢与细胞质信号传导的关键界面[10]。

电压依赖性阴离子通道（VDACs）是线粒体外膜中最丰富的孔形成蛋白，介导线粒体与细胞质之间离子、核苷酸和代谢底物的交换[11]。在三种哺乳动物VDAC异构体（VDAC1、VDAC2和VDAC3）中，VDAC1表达最广泛且功能最活跃[12]。VDAC1调节ATP/ADP的流动，影响线粒体代谢输出，并参与与细胞凋亡相关的通透性途径的形成[13]。除了其生理功能外，VDAC1越来越多地被认为是在病理条件下调节线粒体介导的细胞死亡的关键调节因子。在细胞应激下，VDAC1可以寡聚化形成高传导性通道，促进促凋亡因子（如细胞色素c）的释放，从而将线粒体代谢应激与内在凋亡途径的激活联系起来[14]。VDAC1的异常表达和寡聚化已在多种疾病中被报道，包括神经退行性疾病、缺血再灌注损伤、代谢相关性脂肪肝病和癌症。

越来越多的证据表明，高血糖可能调节VDAC1的表达和活性[15]。据报道，高葡萄糖会增加VDAC1的丰度并在多种细胞类型中诱导线粒体功能障碍[12]，[16]。鉴于β细胞对线粒体代谢的依赖性，VDAC1的失调在糖尿病背景下可能产生特别有害的影响。然而，尽管有这些观察结果，VDAC1在葡萄糖毒性诱导的胰腺β细胞损伤中的确切作用仍不完全清楚。特别是，VDAC1的激活是否直接导致线粒体功能障碍和β细胞死亡，或者仅仅是代谢应激的次要后果，目前尚不清楚。此外，将VDAC1的药理学抑制与葡萄糖毒性条件下β细胞线粒体功能保护直接联系起来的机制证据仍然有限。这些未解决的问题突显了全面研究VDAC1在胰腺β细胞中调节线粒体的必要性。

因此，针对线粒体功能障碍作为糖尿病治疗策略引起了极大的兴趣。然而，许多针对线粒体的方法缺乏特异性，可能会损害重要的代谢功能。在这方面，选择性调节线粒体外膜通道是一种有前景的替代策略。VBIT-4（电压依赖性阴离子通道抑制剂-4）是一种小分子化合物，可选择性抑制病理性VDAC1寡聚化而不阻断基础代谢物运输[17]。在非糖尿病疾病模型中的先前研究表明，VBIT-4可以保持线粒体膜电位，减少氧化应激，并抑制细胞凋亡，显示出其作为线粒体稳定剂的潜力[18]。过去十年的结构研究表明，VBIT-4特异性靶向VDAC1并防止其寡聚化，从而调节线粒体信号通路。2008年，通过NMR和X射线晶体学首次解析了VDAC1的结构，揭示了其跨膜运输离子和代谢物所必需的新的α-螺旋连接的β-桶结构[19]，[20]。后续的结构工作进一步表征了VDAC1二聚体和更高阶寡聚体在脂质双层中的动态组装，最近的冷冻电镜研究阐明了VDAC1六聚体形成的分子基础[21]。2016年，通过化合物库筛选首次鉴定出VBIT-4作为VDAC1寡聚体的选择性抑制剂[22]，并提出了其在神经退行性疾病、自身免疫疾病和代谢性疾病（包括T2DM）中的治疗潜力[23]，[24]，[25]。然而，VBIT-4在暴露于葡萄糖毒性应激的胰腺β细胞中的保护作用尚未系统研究，VBIT-4与VDAC1在蛋白质水平上的分子相互作用也尚未充分表征。因此，在本研究中，我们旨在全面研究VDAC1在葡萄糖毒性诱导的β细胞功能障碍中的作用，并评估VBIT-4的保护效果。使用两种胰腺β细胞系，我们研究了长期高葡萄糖暴露对细胞代谢、线粒体功能、氧化应激和细胞存活率的影响，并通过VDAC1过表达和药理学抑制方法来阐明其因果作用。同时，从大肠杆菌中表达了重组VDAC1蛋白，并使用生物层干涉测量和分子动力学模拟研究了VBIT-4与VDAC1之间的相互作用。通过整合细胞、生化和结构分析，本研究阐明了VDAC1介导葡萄糖毒性引起的线粒体功能障碍和β细胞损伤的机制，确立了VDAC1作为潜在的线粒体治疗靶点，并为VBIT-4作为糖尿病中β细胞保护策略的开发提供了理论基础。

材料与试剂

表达载体pCDH-CMV-VDAC1-Puro（5.8 kb）用于稳定过表达实验，该载体在CMV启动子控制下编码全长大鼠VDAC1（rVDAC1）编码序列。空骨架载体pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro购自Tsingke Biotechnology Co., Ltd.（武汉，中国）。用于His标签纯化的Ni-NTA琼脂糖（L-2008）购自Lingyin Biotechnology Co., Ltd.（上海，中国）。兔多克隆抗VDAC1抗体（编号10866–1-AP）...

高葡萄糖破坏胰腺β细胞的代谢平衡和线粒体功能

为了建立稳健的葡萄糖毒性模型，首先在MIN6和INS-1细胞中评估了不同葡萄糖浓度（48小时）下的关键代谢参数。这些葡萄糖浓度是基于我们之前的研究选择的，这些研究表明长期高葡萄糖会导致β细胞的代谢应激和线粒体功能障碍[30]。MIN6细胞分别用25 mM、33 mM、45 mM、65 mM、100 mM或150 mM的葡萄糖处理，而INS-1细胞...

讨论

在本研究中，我们系统研究了VDAC1在高葡萄糖诱导的β细胞功能障碍中的作用，并阐明了选择性VDAC1抑制剂VBIT-4的保护效果。我们的结果表明，长期高葡萄糖暴露破坏了β细胞的代谢平衡，诱导了线粒体功能障碍，并促进了氧化应激，最终导致β细胞损伤。重要的是，我们发现VDAC1的上调是这些现象背后的核心分子事件...

结论

总之，本研究确定VDAC1是连接葡萄糖毒性应激与线粒体功能障碍和β细胞损伤的关键介质。长期高葡萄糖暴露破坏了β细胞的代谢平衡，增加了氧化应激，并损害了线粒体活性，这些病理变化伴随着VDAC1的显著上调和寡聚化。功能实验进一步证明，仅VDAC1的过表达就足以再现...

缩写

VDAC1
电压依赖性阴离子通道1
VBIT-4
VDAC1寡聚化抑制剂-4
HG
高葡萄糖
LG
低葡萄糖
ΔΨm
线粒体膜电位
ROS
活性氧
ATP
三磷酸腺苷
BLI
生物层干涉测量
MD
分子动力学
MST
微尺度热泳
IPTG
异丙基β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷
LDAO
N,N-二甲十二烷基胺N-氧化物
Ni-NTA
硝基三乙酸镍
CMC
羧甲基纤维素
SDS-PAGE
十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳
PBS
磷酸盐缓冲液

CRediT作者贡献声明

姚晨光：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，项目管理，资金获取，正式分析。曾新宇：撰写 – 原稿，可视化，正式分析，数据管理。黄思远：撰写 – 原稿，数据管理。程宏昌：数据管理。黄慧中：数据管理。邹子毅：数据管理。牟波：数据管理。马哈茂德·优素福：撰写 – 审稿与编辑。刘梅：撰写 – 审稿与...

资助

本研究得到了发酵工程重点实验室开放项目资助（中国教育部，资助编号：202409FE19）对C. Yao的支持，以及HBUT国家“111”细胞调控中心的合作资助对C. Yao的支持。

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

致谢

本研究得到了发酵工程重点实验室开放项目的支持。