《Chemical & Biomedical Imaging》：Label-Free Imaging of Matrix Mineralization in Alginate-Encapsulated Bone Spheroids Using Coherent Raman Scattering Microscopy
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三维(3D)骨细胞培养模型（如骨球）的基质矿化表征是骨组织工程(BTE)的挑战。传统染色法（如ARS、Calcein）在3D模型中受限。本研究将相干拉曼散射(CRS)显微技术，特别是受激拉曼散射(SRS)和二次谐波产生(SHG)显微技术结合，应用于海藻酸盐包裹的骨球，实现了对胞外基质(ECM)中磷酸盐矿化沉积物和无标签胶原基质的无标记、化学特异性成像。SRS在960 cm-1处成功检测到矿化核心区域，SHG提供了胶原基质的互补信息。该技术为完整3D骨模型的综合表征提供了一种强大且前景广阔的方法。
在探索骨骼奥秘的征途上，科学家们一直致力于在实验室中重建和理解这一复杂组织的形成过程。骨骼不仅为身体提供支撑，其内部持续进行的矿化过程——即坚硬的磷酸钙矿物在柔软的胶原蛋白基质中有序沉积——更是维持骨骼健康与功能的核心。传统的实验室研究通常将骨细胞在培养皿平面上铺成单层（二维培养）进行观察。然而，这种“平面化”的生长方式与骨骼在人体内复杂的三维（3D）微环境相去甚远，无法完全模拟细胞与细胞、细胞与其周围基质（胞外基质，ECM）之间丰富的相互作用。
为了更真实地模拟体内情况，三维细胞培养模型应运而生，其中“骨球”（由骨细胞聚集形成的微型球状结构）备受关注。它能更好地复制生理环境，是进行复杂骨研究的理想模型。但随之而来的是一个新挑战：我们该如何“看清”这些三维小球内部的矿化情况？传统方法，如茜素红S(ARS)或钙黄绿素(Calcein)染色，虽然在二维平面上行之有效，但应用到三维结构时却常常“失灵”。染料可能无法均匀渗透到球体核心，信号在厚样本中衰减，甚至可能与包裹细胞的凝胶材料（如本研究使用的海藻酸盐）发生非特异性结合，导致结果不可靠或产生误导。因此，开发一种无需染色、能对完整三维骨模型进行高分辨率、化学特异性成像的技术，成为了骨组织工程(BTE)领域一个迫切的需求。
本项研究正是为了应对这一挑战而展开。研究人员探索了将先进的相干拉曼散射(Coherent Raman Scattering, CRS)显微技术应用于海藻酸盐包裹的骨球，旨在实现对基质矿化的无标记、全面表征。这项研究最终成功证明，结合受激拉曼散射(Stimulated Raman Scattering, SRS)和二次谐波产生(Second Harmonic Generation, SHG)显微技术，可以成为剖析三维骨模型矿化状态的强大工具。相关成果发表在《Chemical 》期刊上。
为开展此项研究，作者主要运用了以下几项关键技术方法：首先，建立了小鼠前成骨细胞系MC3T3-E1的单层培养和海藻酸盐包裹的三维骨球培养模型，并利用成骨培养基诱导其分化矿化。其次，使用了包括茜素红S(ARS)、钙黄绿素(Calcein)和商业化试剂OsteoImage在内的传统染色方法，作为评估矿化的基准和对比。核心技术创新在于，采用了基于莱卡Stellaris 8 CRS系统的相干拉曼散射显微平台。该平台整合了SRS（在透射方向检测）和SHG/CARS（在反射方向检测）成像能力，通过调节泵浦光和斯托克斯光的频率差，分别针对磷酸根离子(PO43-，对应拉曼位移960 cm-1)和脂质中的C-H键（对应拉曼位移2857 cm-1）进行化学特异性成像。此外，研究还辅以透射电子显微镜(Transmission Electron Microscopy, TEM)对矿化沉积物的超微结构进行了验证。
研究结果
2.1. 通过比色和荧光测定法评估单层细胞培养物和海藻酸盐包裹球体中的基质矿化
研究人员首先在MC3T3-E1单层细胞中验证了ARS、Calcein和OsteoImage能有效检测成骨培养基(OM)培养4周后产生的矿化沉积。然而，当将这些方法应用于同样培养4周的海藻酸盐包裹骨球时，问题出现了。明场图像无法提供矿化信息；ARS虽然能在OM培养的球体中显色，但存在染料渗透性问题；Calcein则在成骨培养基(OM)和常规培养基(RM)培养的球体中均产生了荧光信号，且海藻酸盐凝胶本身也有背景荧光，特异性不足；OsteoImage则因强烈染色凝胶而完全无法观察内部球体。这些结果表明，传统染色法对于三维水凝胶包裹的骨球模型并不可靠，凸显了对无标记成像技术的需求。
2.2. 应用相干拉曼散射显微技术进行矿化分析
为满足三维骨ECM无标记分析的需求，本研究采用SRS显微技术结合SHG显微技术对骨球进行成像。SRS具有无需标记、信号与目标化学基团浓度直接相关、无CARS中的非共振背景干扰等优势，且作为多光子技术，具有更深的成像穿透力。
2.2.1. 通过SRS检测单层细胞培养物中的矿物沉积
在单层细胞验证中，研究人员先在成骨诱导的MC3T3-E1单层细胞上进行了自发拉曼光谱扫描，确认了963 cm-1处存在磷酸盐特征峰。随后，SRS在960 cm-1处成功成像出磷酸盐富集区域，同时epi-SHG（反射式SHG）显示出覆盖细胞的胶原层。两者叠加图像显示，矿物沉积多发生于胶原致密的区域。透射电镜(TEM)结果进一步证实了胶原丰富的ECM中嵌有电子致密的矿物沉积。而在常规培养基培养的细胞中，则未检测到SHG胶原信号和特异的SRS磷酸盐信号。
2.2.2. 结合SRS和Epi-SHG成像分析海藻酸盐包裹骨球中的矿化ECM
将SRS/SHG应用于骨球成像取得了成功。在成骨培养基培养的骨球中，SRS在960 cm-1处清晰显示出代表磷酸盐富集区域的亮区。对感兴趣区域(ROI)进行拉曼光谱扫描，证实了这些SRS阳性区域在960 cm-1处存在特征峰，而SRS阴性区域及周围水凝胶则没有，验证了SRS信号的特异性。SHG成像显示了胶原基质，但通道内同时包含了细胞自发荧光的贡献。利用显微镜的TauContrast和TauSeparation（基于光子到达时间的分离功能），研究人员有效区分了快速的SHG信号（胶原，寿命约0.2 ns）和慢速的自发荧光信号（寿命约1 ns），实现了胶原信号的纯化提取。透射电镜也在球体ECM中观察到了小尺寸的矿物沉积，与SRS结果相互印证。
2.2.3. 通过与钙黄绿素荧光比较验证无标记SRS成像
为了直接比较，研究人员对用Calcein培养的骨球同时进行SRS成像和双光子荧光(TPF)成像。结果显示，在球体外围，SRS阳性区域与Calcein荧光区域有重叠；然而，在球体核心区域，虽然SRS检测到了强烈的磷酸盐信号，却几乎没有对应的Calcein荧光。这揭示了Calcein染料可能无法有效渗透至球体核心，而SRS则可以无阻碍地对整个球体体积（包括核心）进行成像，并且其检测的是磷酸根的特异性振动，而非像Calcein那样与任何钙源结合，因此更加特异和可靠。
2.2.4. 比较SRS和CARS以定位脂质丰富区域进行细胞定位
最后，研究比较了SRS和相干反斯托克斯拉曼散射(CARS)在2857 cm-1（脂质C-H键）对细胞（脂质丰富区域）的成像效果。对比发现，CARS图像中存在额外的背景信号。当关闭斯托克斯激光时，该背景信号在CARS通道中依然存在，表明它来源于双光子激发的自发荧光，而非振动共振的CARS信号。而SRS通道则完全不受此非共振背景和荧光的干扰，提供了更特异的化学对比。同时采集960 cm-1（矿物）和2857 cm-1（脂质/细胞）的SRS图像，可以在一张图中概览骨球内矿物沉积和细胞分布的空间关系。
结论与意义
本研究系统地证明，受激拉曼散射(SRS)显微技术是进行海藻酸盐包裹骨球基质矿化无标记成像的一种前景广阔的方法。研究人员首先确认了传统比色和荧光测定法在三维骨球模型中存在局限。进而，成功利用SRS在960 cm-1处实现了对矿化沉积物（磷酸钙）的特异性、高分辨率成像，并能探测到染料无法到达的球体核心区域。同时，二次谐波产生(SHG)显微技术提供了胶原基质组织和分布的互补信息。
这项研究的重要意义在于，它展示了一种强大的组合成像方案（SRS + SHG），能够对复杂的三维骨组织工程模型进行全面、无标记、化学特异性的体内表征。该方法无需破坏性切片或可能引入假象的染色步骤，即可同时获取关于ECM矿化状态和有机基质（胶原）组织的关键信息。这不仅深化了我们对三维骨模型矿化过程的理解，也为未来骨组织工程研究、药物筛选以及骨相关疾病机制探索提供了更优的、非侵入性的分析工具，标志着在实现更真实、更精细的体外骨研究模型表征方面迈出了重要一步。
