新型高效选择性STAT3靶向蛋白降解剂SD-965的发现及其抗肿瘤活性研究

《Journal of Medicinal Chemistry》：Discovery of SD-965 as a Potent, Selective, and Efficacious STAT3 PROTAC Degrader

本研究致力于攻克传统上难以成药的靶点STAT3蛋白，该蛋白在约70%的人类癌症中过度表达或异常激活。研究人员通过PROTAC（蛋白水解靶向嵌合体）技术，设计、合成并系统评估了一系列新型STAT3降解剂。他们最终成功鉴定出SD-965，这是一种高效、高选择性且具有强大体内药效的STAT3降解剂。体内外实验表明，SD-965能够快速、彻底且持久地耗竭STAT3蛋白，并在多种人类癌症（如白血病、淋巴瘤）的异种移植小鼠模型中显示出优异的抗肿瘤活性，甚至可诱导肿瘤消退，且未观察到毒性迹象。这项研究为STAT3依赖性癌症的靶向治疗提供了一种极具前景的候选药物。

　　

在生命科学的“难成药靶点”名单上，STAT3（信号转导与转录激活因子3）是一个“钉子户”，困扰了科学家们长达三十年。这个位于细胞内的关键转录因子，像一位指挥家，调控着细胞增殖、凋亡、转移、血管生成、免疫抑制和炎症等一系列与癌症发展密切相关的基因表达。不幸的是，在大约70%的人类癌症中，这位“指挥家”都变得异常活跃，导致癌症的发生和发展。因此，长期以来，STAT3都被视为一个极具吸引力的抗癌治疗靶点。然而，尽管科研人员开发了众多靶向STAT3的小分子抑制剂，但这些药物普遍存在效力不足、选择性差、作用机制不明确等问题，使得STAT3成为了一个经典的、传统药物难以有效干预的靶点。

近年来，一项名为PROTAC（蛋白水解靶向嵌合体）的新兴技术，为攻克此类“不可成药”靶点带来了革命性的希望。与抑制剂简单地“堵住”靶蛋白的功能不同，PROTAC分子像一个“双面胶”，一端结合靶蛋白，另一端则招募细胞的蛋白质降解系统，直接将靶蛋白送入“垃圾粉碎机”——蛋白酶体，进行彻底清除。基于此，研究人员将目光投向了利用PROTAC技术来降解STAT3蛋白，以期从根源上消除其致癌功能。

在《Journal of Medicinal Chemistry》发表的本项研究中，研究人员正是沿着这一思路，开展了针对STAT3的PROTAC药物研发工作。他们的目标是设计、合成并评价一系列新型的STAT3 PROTAC降解剂，希望从中发现比已报道的同类分子（如SD-36、SD-91、SD-436）更优的候选化合物。

为了开展研究，研究人员综合运用了多种技术方法。首先，他们进行了基于结构的理性药物设计，通过分析现有STAT3抑制剂与靶蛋白的共晶结构，指导对降解剂中STAT3配体部分的优化。其次，他们进行了系统的化学合成，合成了数十个具有不同连接链长度、不同STAT3配体、不同E3泛素连接酶配体的PROTAC分子。在体外活性评价中，他们使用了灵敏且定量的STAT3 HiBiT（高改进生物发光成像标签）降解分析实验，高通量筛选并量化了各个化合物的降解活性（DC₅₀和D_max）。在细胞水平，他们利用蛋白质印迹法（Western Blot）评估了降解剂对STAT3及其磷酸化形式pSTAT3（Y705）的降解效果，并分析了其对其他STAT家族成员的选择性。此外，他们还在MOLM-16白血病细胞系和SU-DHL-1间变大细胞淋巴瘤细胞系中测试了化合物抑制细胞生长的能力。在体内研究中，团队首先在携带SU-DHL-1肿瘤的小鼠模型中进行了药效动力学（PD）分析，通过单次静脉注射评估了候选化合物在不同时间点对肿瘤和正常组织中STAT3蛋白的耗竭程度和持久性。接着，他们进一步在SU-DHL-1和MOLM-16肿瘤异种移植模型中进行疗效评估，观察候选化合物在每周给药方案下的抗肿瘤效果和动物体重变化。最后，为了评估降解剂的体内药代动力学（PK）性质和吸收、分布、代谢、排泄（ADME）特性，研究人员还测定了其在多种物种（小鼠、大鼠、犬、猴、人）中的微体/血浆稳定性，并进行了小鼠体内的药代动力学实验。

本研究取得了多项重要发现：

结果与讨论：

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  设计使用高亲和力CRBN配体的新型PROTAC STAT3降解剂
  研究人员采用了一种对E3泛素连接酶组分cereblon具有高结合亲和力的新型配体RR-11055，并尝试了不同长度的连接链。初步筛选发现，连接链长度为5个亚甲基的化合物15（DC₅₀= 0.9 μM）在该系列中最有效，但仍不如之前报道的SD-36、SD-91和SD-436。
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  优化STAT3降解剂中的STAT3配体
  通过对STAT3配体尾部（“tail”）区域的深入优化，研究人员发现移除一个苯基、引入间位甲磺酰基等修饰能够显著提升降解活性。其中，化合物25（SD-964）表现尤为突出，在HiBiT分析中DC₅₀达到0.049 μM，是同期筛选中最有效的化合物之一。随后，他们将化合物25中的磷酸酪氨酸模拟物替换为另一种已知稳定的结构，得到了化合物27，即SD-965。尽管SD-965在HiBiT分析中的DC₅₀（0.14 μM）略弱于25，但其在后续细胞生长抑制和体内研究中显示出更均衡和优异的特性。
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  使用不同Cereblon配体设计STAT3降解剂
  研究人员尝试了多种文献报道的cereblon配体来设计基于SD-965骨架的降解剂。结果显示，配体结构及其与连接链的连接位置对降解活性有重大影响。使用Kymera Therapeutics公司公开的新型cereblon配体或用于临床在研药物BMS-986458的配体所设计的降解剂，其活性普遍弱于使用RR-11055的SD-965，这凸显了E3配体优化的复杂性。
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  在癌细胞系中评估代表性有效STAT3降解剂的生长抑制
  在STAT3高活化的MOLM-16和SU-DHL-1癌细胞系中测试细胞生长抑制活性。SD-965和25均表现出纳摩尔级别的强效抑制，其中25活性最强。在比较中，SD-965优于之前报道的SD-36和SD-436，证实了其作为高效STAT3降解剂的潜力。
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  在小鼠中对25和SD-965进行药效动力学评价
  体内PD研究表明，单次静脉注射10 mg/kg的25和SD-965均能快速（6小时内）将肿瘤和正常组织中的STAT3蛋白降低90%以上。然而，SD-965显示出更持久的STAT3耗竭效果，在48小时时STAT3水平仍显著低于25处理组，因此被选定进行后续深入研究。
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  评估SD-965在细胞中的降解选择性
  蛋白质印迹分析显示，在人外周血单核细胞（PBMC）和SU-DHL-1细胞中，SD-965能高效降解STAT3，而对其他STAT蛋白（STAT1, STAT2, STAT5, STAT6）几乎没有影响，表现出优异的选择性。在SU-DHL-1细胞中，SD-965还能有效降解其磷酸化形式pSTAT3（Y705）。机制验证实验证实，其降解作用可被STAT3抑制剂、cereblon配体、NEDD8活化酶抑制剂和蛋白酶体抑制剂所阻断，证明SD-965是一个真正的、依赖泛素-蛋白酶体系统的PROTAC降解剂。
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  在全局水平评估SD-965的降解选择性
  无偏性蛋白质组学分析进一步证实，SD-965在高达1 μM的浓度下处理人PBMC细胞，对超过7000个分析的蛋白质中，仅显著降低STAT3蛋白水平，展现出极高的全局选择性。
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  评估SD-965的ADME和药代动力学特征
  SD-965在多种物种中均表现出极佳的微体稳定性和血浆稳定性，半衰期远大于120分钟。小鼠药代动力学研究显示，SD-965具有中等消除半衰期（1.44小时）、较低的清除率和较高的血浆暴露量，表明其具有良好的体内药代动力学性质。
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  在SU-DHL-1淋巴瘤异种移植模型中评估SD-965的抗肿瘤活性
  疗效实验表明，在SU-DHL-1淋巴瘤小鼠模型中，即使采用每周25 mg/kg的较低剂量静脉给药，SD-965也能诱导最大58%的肿瘤消退，且动物耐受性良好。当剂量提升至每周50 mg/kg时，SD-965可诱导快速且深度的肿瘤消退，在治疗第16天使肿瘤体积减少96%，且60%的小鼠无可触及肿瘤，全程未引起动物体重减轻或其他毒性迹象。
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  在MOLM-16白血病异种移植模型中评估SD-965的抗肿瘤活性
  在MOLM-16急性髓系白血病模型中，单次给药即可在肿瘤组织中实现近乎完全且持久的STAT3耗竭，且不波及其他STAT蛋白。疗效上，每周10 mg/kg的SD-965即可实现98%的肿瘤生长抑制，而30 mg/kg的剂量则能诱导69%的肿瘤消退，同样未观察到任何毒性。

总结：

本项研究系统报道了基于高亲和力cereblon配体，并通过优化连接链和STAT3配体，设计和合成一系列新型STAT3 PROTAC降解剂的过程。其中，SD-965脱颖而出，被鉴定为一种高效、高选择性、且在体内外均表现出强大活性的STAT3降解剂。其在细胞中能特异性且有效地降解STAT3蛋白，而对超过7000个其他蛋白质无明显影响。在体内，单次静脉注射SD-965即可有效诱导小鼠正常组织和人类肿瘤异种移植组织中STAT3蛋白的快速、完全且持久的耗竭，且对STAT家族其他成员高度选择。更关键的是，SD-965在SU-DHL-1淋巴瘤和MOLM-16白血病的小鼠异种移植模型中展现了卓越的抗肿瘤疗效，能够诱导深度甚至完全的肿瘤消退，且在整个治疗过程中未观察到任何毒性迹象。

综上所述，本研究不仅成功开发出了比前代化合物更优的STAT3 PROTAC降解剂，更重要的是，通过SD-965的发现，提供了强有力的证据，表明PROTAC技术能够成功靶向并清除传统上“不可成药”的STAT3蛋白，为治疗STAT3依赖性的人类癌症及其他疾病开辟了一条极具前景的新途径。SD-965作为一个非常有潜力的临床前候选分子，值得进行更广泛的评估，以推动其向临床应用发展。