《Frontiers in Genetics》：CFTR gene variant detection in moroccan individuals via nanopore long-read sequencing
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本研究发现，囊性纤维化(CF)在非洲的诊断面临挑战，标准突变检测因缺乏针对非洲人群的变异数据而漏诊率高。为解决此问题，研究人员以9名摩洛哥个体为研究对象，利用纳米孔长读长测序技术对CFTR基因进行了全基因测序。研究成功识别了多种已知和新型CFTR致病/可能致病性变异，包括p.Phe508del、p.Leu227Arg、p.Arg1162*、p.Ser364Pro和p.Phe1078Ser，并通过生化分析验证了新变异的功能损害。结果显示，基于纳米孔的长读长测序是适用于非洲高遗传异质性人群的一种有效、可及的CF分子筛查工具，有助于改进当地的CF诊断和遗传咨询。
囊性纤维化(CF)是一种严重的遗传病，在全球影响着数万名患者，但并非所有地区都享有同等的诊断资源。尤其是在非洲，由于标准的基因检测套餐是基于欧洲人群的数据设计，面对非洲大陆丰富多样的遗传背景，其诊断“命中率”大打折扣，漏诊率可达25%以上。此外，昂贵的分子诊断成本和有限的筛查手段，使得许多非洲患者无法得到及时的诊断和精准的医疗护理，包括靶向药物治疗。为了破解这一困境，一项旨在评估新测序技术如何提升非洲人群CF诊断效能的研究应运而生，并于近期发表在《Frontiers in Genetics》期刊上。
为了评估这项技术在非洲人群中的可行性，研究人员招募了来自摩洛哥的9名个体，其中包括6名有临床症状的CF疑似患者和3名健康父母。他们开发了一个针对整个CFTR基因（约250 kb）的长读长测序与生物信息学分析流程。其主要技术方法包括：利用11对引物通过长距离PCR扩增覆盖整个CFTR基因的区域，并利用牛津纳米孔技术进行测序；运用一套包含变异检测、分型、注释和分相（phasing）的生物信息学管道分析测序数据，以识别单核苷酸变异、插入/缺失变异和结构变异；通过Sanger测序验证所发现的变异；在HEK293细胞中表达候选CFTR变异蛋白，利用免疫印迹和细胞表面生物素化技术检测其表达水平，以评估变异蛋白的功能缺陷；对特定的CFTR变异体进行体外药物处理，评估其对CFTR调节剂药物的反应。
3.1 非洲-摩洛哥患者测序结果
通过对9名摩洛哥个体的CFTR基因全长测序，研究人员成功识别了多种已知和新型的CFTR变异。在3名汗液氯离子浓度测试阳性的患者中，均检测到致病性变异组合，证实了复合杂合状态。其中，患者F1-II1被鉴定携带p.Phe508del和p.Leu227Arg变异；患者F2-II1携带p.Arg1162*和p.Ser364Pro变异；患者F6-II1携带p.Arg1162*和p.Phe1078Ser变异。此外，在一名汗液测试阴性的患者中仅检测到一个杂合致病性变异p.Arg1162*，另一名阴性患者仅检测到一个杂合的非致病性变异p.Leu997Phe。两名未检测到致病变异的个体，其临床症状与分子结果吻合，提示可能存在非CFTR相关疾病。所有通过ONT测序发现的变异均经过Sanger测序验证。研究建立的生物信息学流程成功对多数变异进行了准确的分相。
3.2 CFTR变体p.Ser364Pro、p.Leu997Phe和p.Phe1078Ser的生化表征
为了评估新发现变异（p.Ser364Pro、p.Phe1078Ser）和已知非致病性变异（p.Leu997Phe）的潜在致病性，研究人员进行了功能验证。免疫印迹结果显示，与野生型（WT）相比，p.Ser364Pro和p.Phe1078Ser变异在总细胞表达和细胞表面表达上均显著降低，其表达缺失程度与已知的致病性对照变异p.Phe508del相当。而p.Leu997Phe的表达水平与WT相似。这些生化数据为p.Ser364Pro（已在CFTR-France数据库中列为致病性）的致病性提供了证据，并表明p.Phe1078Ser是“可能致病”的变异，而非意义未明变异。
3.3 生物素化实验——CFTR调节剂药物对CFTR变体p.Ser364Pro和p.Phe1078Ser的处理
研究人员进一步测试了p.Ser364Pro和p.Phe1078Ser变异对CFTR调节剂药物（包含两种矫正剂elexacaftor、tezacaftor和增效剂ivacaftor）的反应。结果显示，经药物联合处理后，p.Phe1078Ser变异蛋白在细胞表面的成熟C带表达显著增加，其对药物的积极反应与已知有响应的p.Phe508del变异类似。然而，p.Ser364Pro变异对相同药物处理不敏感。
本研究通过功能实验证实，p.Ser364Pro和p.Phe1078Ser变异均导致CFTR蛋白表达降低，支持其致病性。重要的是，p.Phe1078Ser变异对CFTR调节剂药物展现出积极的治疗反应，为其临床管理提供了潜在的靶向治疗希望。研究团队指出，基于纳米孔技术的长读长测序方法，通过对整个CFTR基因（包括编码区和非编码区）进行测序，能够有效地在遗传背景高度异质性的非洲人群中发现致病性变异，包括新型变异。这种方法具有高通量、可并行处理多个样本（通过条形码技术）、成本相对较低的优势，且能够进行准确的变异分相，这对于常染色体隐性遗传病至关重要。所开发的生物信息学流程整合了针对长读长数据的优化工具，能够全面检测单核苷酸变异、插入缺失和结构变异。
综上所述，这项研究验证了纳米孔长读长测序技术在诊断囊性纤维化方面的有效性和准确性。它证明，通过对整个CFTR基因进行测序，并结合生物信息学分析和功能验证，可以显著提高在非洲等高遗传多样性人群中CF致病基因的检出率。这不仅为理解非洲人群CF的突变谱提供了新数据，更重要的是，为资源有限的中低收入国家提供了一种潜在的、可负担的精准分子筛查工具。该技术有望与汗液氯离子测试等传统方法形成互补，提升诊断准确率，并为患者提供遗传咨询和潜在靶向治疗的信息，最终改善非洲CF患者的诊疗现状。
