《Frontiers in Immunology》：Interrogation of glioma immune microenvironment identifies a non-canonical role for microglial Galectin-9 in tumor cell adhesion and phagocytosis
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为探索胶质瘤相关髓系细胞中潜在的抗肿瘤效应分子，研究人员通过单细胞转录组学结合配体-受体（L-R）相互作用组学分析，系统探究了胶质瘤微环境中髓系细胞与淋巴细胞间的通讯网络。该研究发现，在IDH野生型胶质瘤中，小胶质细胞（MG）特异性高表达的Galectin-9是调控胶质瘤干细胞（GSC）黏附和被吞噬过程的关键分子，揭示其不依赖于T细胞抑制作用的、促进吞噬的非经典功能，为胶质母细胞瘤的免疫治疗提供了新思路。
在恶性胶质瘤，尤其是最具侵袭性的胶质母细胞瘤(GBM)中，肿瘤微环境(Tumor Microenvironment, TME)的构成和功能至关重要。其中，胶质瘤相关小胶质细胞/巨噬细胞(Glioma-Associated Microglia/Macrophages, GAMs)占据了TME的“半壁江山”。长期以来，GAMs被普遍认为扮演着“助纣为虐”的免疫抑制角色，帮助肿瘤生长和逃避免疫攻击。因此，许多治疗策略试图“一锅端”地清除或抑制所有GAMs。然而，临床试验结果却不尽如人意。这提示我们，GAMs这个群体内部存在高度的异质性，很可能“鱼龙混杂”——既有促肿瘤的“坏分子”，也可能存在具备抗肿瘤潜能的“好细胞”，比如能吞噬肿瘤细胞的亚群。关键在于，我们如何精确地找出这些“好细胞”，并理解它们发挥抗肿瘤作用的关键分子开关。
为了解答这个难题，并超越将GAMs笼统视为免疫抑制细胞的传统观点，一项发表在《Frontiers in Immunology》上的研究，对胶质瘤免疫微环境进行了深入“审讯”。研究人员利用前期构建的胶质瘤免疫细胞图谱，进行了一项“通讯网络”调查。他们通过单细胞RNA测序(single-cell RNA sequencing, scRNAseq)数据，分析了髓系细胞（如小胶质细胞和树突状细胞）与淋巴细胞之间复杂的配体-受体(Ligand-Receptor, L-R)相互作用网络。这项“网络排查”在IDH野生型胶质瘤中锁定了一个关键信号枢纽：由LGALS9基因编码的Galectin-9蛋白。有趣的是，虽然Galectin-9与其受体Tim-3的相互作用在耗竭T细胞中广为人知，但其在髓系细胞自身中的功能却像是一个“未解之谜”。
为了探究Galectin-9在胶质瘤中的真实角色，研究人员展开了一系列系统性工作。他们首先利用光谱流式细胞术、免疫组化和蛋白质印迹等技术，在多人源样本中确认Galectin-9蛋白大量表达于胶质瘤相关小胶质细胞，而肿瘤细胞本身并不表达。接着，通过差异基因富集分析，他们发现，与不表达Galectin-9的细胞相比，表达Galectin-9的小胶质细胞和巨噬细胞中，与细胞黏附（如coronin 1A、整合素）和吞噬作用（如FcγR、磷脂酶D、Rab家族蛋白等）相关的通路基因显著上调。这强烈暗示Galectin-9可能参与调控这些抗肿瘤相关功能。
为了验证这一猜想，研究团队搭建了一个更接近人体内环境的“微型战场”——将原代人小胶质细胞(primary human microglia, pMG)与患者来源的胶质瘤干细胞共培养。在这个体系中，当他们用小干扰RNA敲低或用中和抗体阻断pMG上的Galectin-9后，通过共聚焦显微镜活细胞成像观察到了一个明确的现象：小胶质细胞对胶质瘤干细胞的黏附能力显著下降了。更关键的是，紧随黏附之后的关键步骤——吞噬作用，也受到了 dramatic 的削弱。无论是敲低基因还是中和表面蛋白，都导致了吞噬效率和吞噬量的双双降低。这表明，Galectin-9就像是小胶质细胞捕捉并“吃掉”肿瘤细胞的“机械手”和“开胃剂”，对其黏附和吞噬功能都起到了关键的促进作用。
这项研究综合运用了多种关键技术方法来验证科学假设。首先，研究的基石是来自18名IDH分层胶质瘤患者的肿瘤样本，通过单细胞RNA测序构建了免疫细胞图谱，并以此为基础利用CellPhoneDB工具进行了系统的配体-受体相互作用组学分析，以发现潜在的细胞通讯关键分子。其次，为了在蛋白水平验证表达谱，研究采用了多色光谱流式细胞术对胶质瘤亚型队列（包括IDH突变型/野生型的原发与复发样本）的免疫细胞进行了表面蛋白检测，并辅以蛋白质印迹和多重免疫组化在组织原位确认蛋白表达与定位。最后，功能验证的核心是建立了一套人源化的离体共培养模型，将原代培养的人小胶质细胞与表达荧光报告基因的患者来源胶质瘤干细胞共培养，通过活细胞共聚焦成像技术，定量分析在基因敲低（siRNA）或抗体中和干预下，细胞黏附和吞噬事件的变化，从而直接评估Galectin-9的功能。
3.1 L-R相互作用组分析揭示Galectin-9/Tim-3是胶质瘤中的主要免疫检查点轴
通过分析IDH野生型(IDH-wt)和IDH突变型(IDH-mut)胶质瘤患者髓系与淋巴细胞间的L-R相互作用，研究发现Galectin-9是髓系细胞（尤其是小胶质细胞）与CD8+T细胞、NK/NKT细胞相互作用网络中的关键节点，其作用在IDH-wt胶质瘤中尤为突出，提示其可能是一个重要的通讯枢纽。
3.2 Galectin-9蛋白在胶质瘤相关髓系细胞中广泛表达
流式细胞术分析证实，Galectin-9蛋白在胶质瘤相关的小胶质细胞、巨噬细胞等髓系细胞中高表达，尤其是在IDH-wt原发胶质瘤的小胶质细胞中比例显著高于IDH突变型。相比之下，其经典受体Tim-3在T细胞等淋巴细胞上高表达，但不同胶质瘤亚型间差异不显著。
3.3 恶性胶质瘤细胞不表达Galectin-9蛋白
通过蛋白质印迹分析分选的肿瘤细胞和免疫细胞，以及免疫荧光共染色（Galectin-9与星形胶质细胞标志物Nestin）证实，Galectin-9蛋白表达限于肿瘤相关白细胞（CD45+），特别是Iba-1+的吞噬细胞，而恶性胶质瘤细胞本身并不表达该蛋白。
3.4 黏附和吞噬相关基因在Galectin-9+小胶质细胞和巨噬细胞中富集
对IDH-wt胶质瘤单细胞数据的深度分析显示，高表达Galectin-9的小胶质细胞和巨噬细胞，其差异富集的基因显著集中于细胞黏附（如CORO1A、ITGAL）和吞噬作用（如FCGR1A、TREM2、RAB家族基因等）相关通路，从转录组层面提示Galectin-9+细胞亚群具有更强的吞噬相关潜能。
3.5 小胶质细胞中的Galectin-9表达介导胶质瘤细胞黏附
在原代人小胶质细胞与胶质瘤干细胞的共培养体系中，利用siRNA敲低Galectin-9或使用中和抗体阻断其功能后，共聚焦成像分析显示，小胶质细胞对胶质瘤干细胞的黏附比例显著下降，证明Galectin-9（尤其是其表面形式）是介导二者黏附的关键分子。
3.6 Galectin-9调控小胶质细胞对胶质瘤细胞的吞噬
在同一共培养体系中进行的活细胞成像分析进一步发现，敲低或中和Galectin-9不仅降低了发生吞噬的小胶质细胞比例（吞噬率），也减少了每个细胞所吞噬的胶质瘤干细胞数量。这表明Galectin-9对小胶质细胞清除肿瘤细胞的关键功能——吞噬作用，具有正向调控作用。
综上所述，本研究通过对人胶质瘤免疫微环境的系统性“审讯”，揭示了一个此前未被充分认识的、关于Galectin-9的非经典功能。该研究得出结论：在IDH野生型胶质瘤中，肿瘤相关小胶质细胞高表达的Galectin-9，并非通过作用于T细胞的经典抑制途径，而是通过一种细胞自主（cis-acting）的方式，充当了调控胶质瘤干细胞黏附及后续吞噬过程的关键分子开关。这一发现具有双重重要意义：首先，它突破了Galectin-9主要作为T细胞免疫检查点配体的传统认知，为其在髓系固有免疫中的功能提供了新见解；其次，更重要的是，它指出了靶向Galectin-9在胶质瘤治疗中的潜在双刃剑效应。传统旨在阻断Galectin-9/Tim-3轴以“解放”T细胞的治疗策略，可能会无意中削弱小胶质细胞这一重要的抗肿瘤吞噬功能，从而带来不可预见的负面影响。因此，本研究强调，未来的胶质母细胞瘤免疫治疗策略需要更加精细化。研究团队在讨论中提出，与其单纯阻断，不如考虑利用Galectin-9的促吞噬特性，例如开发Galectin-9激动剂或将其工程化改造为促吞噬受体，从而开辟一条旨在增强固有免疫吞噬功能、清除肿瘤细胞的新治疗途径。这为对抗这种毁灭性脑癌提供了新的思路和潜在靶点。
