《Frontiers in Immunology》：Hit-and-run hypothesis: revisiting the impact of EBV in malignancies
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这篇综述深入探讨了爱泼斯坦-巴尔病毒（EBV）在肿瘤发生中一个引人深思的假说——“肇事逃逸”（hit-and-run）机制。文章回顾了该假说的起源，系统总结了当前关于病毒游离体丢失、基因组整合入宿主染色体的证据，并重点分析了高灵敏度检测方法（如定量PCR、RNAscope、单细胞微滴数字PCR等）在揭示传统方法“阴性”的淋巴瘤和癌瘤中病毒踪迹方面的最新进展。作者指出，即使病毒消失，其诱导的表观遗传和突变特征可能持续影响肿瘤进展，这对理解EBV的致癌作用、优化患者分层诊断以及开发靶向疗法具有重要意义。
摘要
爱泼斯坦-巴尔病毒（Epstein-Barr virus, EBV）感染了全球超过90%的人口，并被病因学关联到广泛的淋巴和上皮来源的恶性肿瘤。尽管其作为致癌病毒的作用已得到确认，但EBV促进肿瘤发生的具体机制仍未完全阐明。这篇综述重新审视了EBV相关癌症中的“肇事逃逸”假说，提出病毒可能在启动致癌转化后，离开肿瘤细胞。文章总结了当前关于EBV游离体丢失、整合入宿主染色体的证据，以及检测病毒遗传物质踪迹所面临的挑战。高灵敏度检测方法的最新进展，例如定量聚合酶链反应（quantitative polymerase chain reaction, qPCR）、RNAscope和单细胞微滴数字PCR（single-cell droplet digital PCR, sc-ddPCR），在那些曾被常规原位杂交认为是EBV阴性的淋巴瘤和癌瘤中揭示了病毒踪迹，这支持了EBV在肿瘤发生中更广泛的作用。此外，带有EBV踪迹的肿瘤具有与EBV阳性患者相似的表观遗传和突变图谱，表明EBV诱导的改变即使在病毒丢失后仍可能持续产生影响。尽管有这些发现，但目前仍不清楚残留的病毒成分是否持续贡献于肿瘤微环境内的致癌信号传导、表观遗传改变或免疫调节。研究这些因素可能提高我们基于EBV状态对患者进行分层、完善诊断标准和开发更具靶向性的治疗方法的能力。
1 引言
1964年，安东尼·爱泼斯坦领导的团队与伊冯·巴尔和伯特·阿琼一起，在一株源自非洲伯基特淋巴瘤患者组织的肿瘤细胞系（EB1）中发现了疱疹病毒样颗粒。后来，该病毒被命名为爱泼斯坦-巴尔病毒。如今，EBV被正式归类为人疱疹病毒4型，是γ疱疹病毒亚科的成员，并在20世纪90年代末被国际癌症研究机构和世界卫生组织列为1类致癌物。
EBV具有极其广泛的宿主范围，在全球超过90-95%的成年人口中持续存在，通常在儿童期无症状初次暴露后建立终生潜伏感染。虽然在大多数个体中EBV保持临床静默，但它已被病因学关联到多种淋巴和上皮恶性肿瘤。EBV相关癌症谱系包括B细胞淋巴瘤，如地方性伯基特淋巴瘤、经典型霍奇金淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、移植后淋巴增殖性疾病和自然杀伤/T细胞淋巴瘤，以及上皮肿瘤如鼻咽癌和EBV相关胃癌。除肿瘤学外，EBV通过其对免疫调节和B细胞功能的影响，越来越多地牵涉到自身免疫性疾病如多发性硬化症以及最近的原发性硬化性胆管炎的发病机制中。尽管EBV相关恶性肿瘤带来了巨大的全球负担，每年约有20万新发癌症病例，但EBV促进肿瘤发生的精确机制仍未完全了解。在本综述中，我们重新审视了EBV介导的“肇事逃逸”致癌概念，探讨了支持证据以及当前检测方法的局限性。
2 EBV生物学与潜伏期
在发展中国家，大多数原发感染是无症状的，通常发生在婴儿期和幼儿期。相比之下，在发达国家，当原发感染发生在青壮年时，约有50%的概率出现被称为传染性单核细胞增多症的典型症状。用于区分急性感染个体与长期携带者的常规非侵入性血清学方法，通常使用嗜异性抗体、免疫荧光免疫测定和酶联免疫吸附测定。病毒主要通过唾液传播，原发感染被认为发生在口腔黏膜。然而，关于唾液传播过程中EBV感染的精确起源存在争议。一些研究者认为EBV首先感染口咽上皮细胞，在那里复制并释放病毒粒子，进而感染瓦尔代尔环淋巴结构中的邻近B细胞
。另一些人提出，EBV进入扁桃体隐窝，穿过薄薄的上皮层，通过一种尚未明确的机制感染滤泡套内的初始B细胞。支持这一假设的是，一项前瞻性研究在症状出现前三周就在外周血中检测到了EBV基因组，这表明B细胞是EBV在口腔扩增之前的主要储存库。人原代B淋巴细胞通过主要病毒外膜糖蛋白gp350/220与B细胞表面的CD21受体相互作用而感染，gp42促进这一过程，通过与主要组织相容性复合体II类分子形成复合物，允许B细胞进入。此外，最近鉴定的宿主受体R9AP直接与病毒gH/gL复合物相互作用，启动gH/gH/gH/gL-gB介导的膜融合，作为促进膜融合和增强EBV进入B细胞的关键辅助受体。
原发感染后，EBV在外周血建立潜伏感染，其特征是病毒产生减少，以此方式确保在最小影响下持续存在。EBV潜伏有四种模式，其定义基于体外感染和EBV相关肿瘤中表达的EBV蛋白和小RNA模式。在淋巴母细胞样细胞系中，EBV基因组通常表达所有潜伏基因。这被称为潜伏期III，也称为生长程序，包括六种爱泼斯坦-巴尔核抗原、三种潜伏膜蛋白、两种小的非聚腺苷酸化RNA以及来自BamHI-A区域的转录本。潜伏期III程序也见于医源性免疫缺陷淋巴瘤，如移植后淋巴增殖性疾病、原发性中枢神经系统淋巴瘤、伴有原发性免疫障碍的非霍奇金淋巴瘤、部分EBV阳性非特指型弥漫性大B细胞淋巴瘤，以及与慢性炎症相关的DLBCL。
潜伏期II，也称为默认程序，其中表达EBNA1和LMP蛋白，通常见于经典型霍奇金淋巴瘤、部分EBV阳性DLBCL、淋巴瘤样肉芽肿病、血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤、结外NK/T细胞淋巴瘤、侵袭性NK细胞白血病、鼻咽癌和胃癌。在潜伏期I，仅表达EBNA1，见于伯基特淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤以及HIV感染免疫缺陷患者的浆母细胞淋巴瘤。潜伏期0，不表达任何EBV抗原，使细胞能够逃避免疫检测，通常见于健康个体的循环记忆B细胞。EBER和病毒miRNA的表达在所有EBV潜伏类型中持续存在。EBV也可以响应某些触发因素周期性再激活，从潜伏期转变为裂解周期。在此过程中，产生传染性病毒颗粒并传播给新宿主
。部分个体可能发展为慢性活动性EBV感染，这是一种T细胞疾病，其特征是持续或反复的病毒复制、血液中EBV DNA水平显著升高，以及临床症状，如EBV感染淋巴细胞对器官的浸润。
3 EBV在人类细胞中的感染与维持
潜伏期确保了EBV基因组——一个约170,000 bp的双链闭合环状DNA分子——在宿主细胞中作为染色体外环状游离体得以维持。EBV游离体在有丝分裂期间与细胞染色体相关联，并在S期由细胞DNA聚合酶复制。锚定到宿主染色体对病毒基因组的游离体维持至关重要。稳定地将病毒维持在分裂的人类细胞中需要两个EBV组分：被称为质粒复制起点的顺式作用DNA片段，以及反式作用的EBNA-1蛋白。EBNA-1的C末端介导与oriP DNA的特异性结合，并增加复制DNA的初始积累，但不能介导有丝分裂染色体关联或游离体持久性。EBNA-1的N末端对于有效积累复制的oriP DNA和长期游离体持久性是必需的，它允许EBV游离体锚定在细胞染色质上。这意味着EBNA-1基本结构域的突变可能对增强oriP依赖性转录、增加复制DNA和实现游离体持久性产生多效性抑制作用。与此一致，先前的研究表明，删除EBNA-1对初始DNA复制几乎没有影响，但几乎根除了游离体持久性。由于游离体维持是EBV持久性和致癌作用的基础，这一现象已在组织培养中使用重组质粒以及肿瘤来源的细胞系中得到了广泛研究。
在组织培养中，表达EBNA1的细胞将在每个细胞周期中复制一次含有EBV潜伏复制起点的重组细菌质粒。如果质粒携带抗生素抗性基因，该质粒将在抗生素选择压力下稳定维持。在没有抗生素选择压力的情况下，每个世代有一定百分比的细胞会丢失质粒，直到培养的细胞最终不含质粒，这表明当没有维持游离体的选择压力时，EBV游离体就会丢失。类似地，源自EBV阳性活检组织的鼻咽癌细胞系在长期培养中经常丢失EBV基因组。此外，在一些EBV阳性伯基特淋巴瘤细胞系中，EBV DNA在大约2年的体外培养后丢失。安宾德及其同事报告说，当EBV进入裂解周期时，会导致裂解基因的激活和随后对维持游离体至关重要的EBNA1转录的下调，从而发生游离体丢失。
另一方面，迪特默及其同事描述了鼻咽癌中两个连续且机制不同的游离体丢失阶段：第一个阶段快速而广泛；第二个阶段缓慢，且与培养中的传代次数呈线性相关。此外，在第一个阶段，由于病毒无法在所有细胞中建立稳定的潜伏感染，病毒游离体被完全快速丢失，而在“慢”阶段，EBV基因组通过缺失和连续突变而丢失。EBV丢失背后的调节因子和分子机制仍然未知；然而，可以推测，在“快速丢失阶段”，一种宿主因子变得限制性，高EBV游离体负荷可能不利于培养中的生长。相反，在“慢丢失阶段”，自然发生的重组和突变事件可以产生稳定的游离体。这在一些伯基特淋巴瘤细胞系中得到证实，这些细胞系在发生大片段缺失后丢失了EBV基因组。然而，同样的论点可能不适用于其他伯基特淋巴瘤细胞系，这些细胞系保留了病毒，并且需要某些EBV转化功能来支持培养中的生长。事实上，如果保留了EBV基因组，与失去病毒的同基因克隆相比，这些细胞生长更快，对凋亡更具抵抗力，并且在裸鼠中更具致瘤性。
已显示EBV游离体在几个伯基特淋巴瘤细胞系以及鼻咽癌中与整合的基因组共存。此外，源自一例非洲伯基特淋巴瘤的Namalwa细胞系携带两个整合的EBV基因组拷贝，但缺乏EBV游离体。EBV基因组可能整合到人类染色体中的概念出现在20世纪70年代中后期，当时林达尔及其同事提供的证据表明，在伯基特淋巴瘤和鼻咽癌细胞中可能存在少量整合的病毒基因组拷贝。整合的病毒基因组主要以线性的亚基因组片段形式存在，并且病毒基因转录仍可发生。事实上，在携带单个EBV整合拷贝的细胞系中，可以记录到潜伏基因的表达。由于缺乏对EBV整合景观的全基因组范围系统研究，EBV整合是遵循随机还是非随机分布仍然存在争议。然而，莱斯图等人观察到，在大多数携带整合EBV基因组的细胞系中，EBV整合频繁发生在特定的染色体带，包括1p31、1q43、2p22、3q28、4q13、5p14、5q12和11p15。
在某些情况下，EBV整合可以发现于可能存在相关细胞基因的位置，例如Namalwa细胞中的MACF1、Raji细胞中的BACH2，以及NAB-2细胞中的REL和BCL-11A。EBV整合位点的数量与染色体结构变异和拷贝数结构变异的总负荷呈正相关。大多数断点位于基因组结构变异的区域内部或附近，这表明EBV整合可能是由宿主基因组不稳定性驱动的，而整合过程本身可能进一步加剧这种不稳定性。因此，这些整合位点可能成为易断裂的染色体区域，类似于脆弱位点，可能导致病毒和宿主DNA的丢失。这提出了在特定条件下，EBV可能通过“肇事逃逸”机制促进致癌作用的可能性，即病毒在因整合到细胞内的脆弱基因组位点而丢失之前，短暂表达其蛋白，甚至以线性形式。
4 肇事逃逸假说：机制与挑战
病毒“肇事逃逸”在致癌作用和恶性肿瘤中的概念最早由斯金纳于1976年在HSV-2的背景下提出。根据这个模型，病毒可以在不需要维持其基因组的情况下，在受感染的细胞中诱导恶性转化。有观点认为，病毒可能充当“肇事逃逸”癌基因，意味着病毒可以驱动早期致癌事件，但不需要在已建立的肿瘤中持续存在。此外，这一概念已在几种致癌病毒的背景下得到进一步探索，包括腺病毒、多瘤病毒和γ疱疹病毒。该假说也被提出用于EBV，表明在细胞系中（可能也在患者中）观察到的病毒基因组丢失可能有助于疾病进展。
“肇事逃逸”假说提出，由病毒启动的致癌效应后来由宿主细胞内稳定的遗传或表观遗传改变所维持，使得病毒本身对肿瘤维持不再必要。在这种情况下，在细胞分裂过程中本质上易于不完美增殖的EBV游离体，可能会逐渐从肿瘤克隆中丢失。这一概念表明，EBV可能在肿瘤早期起到病原学作用，但在后期阶段不再可检测到，无论是作为病毒还是通过其基因表达，这就提出了病毒持久性是否总是癌症发展所必需的问题。然而，支持“肇事逃逸”机制在致癌作用中的明确生物学证据仍然缺乏。这一挑战因使用常规EBV检测方法难以最终证明或排除“肇事逃逸”致癌作用而变得更加复杂。
确定癌症中EBV状态的金标准技术包括EBV编码RNA的原位杂交，可以辅以灵敏度较低的方法，例如针对病毒蛋白LMP1或EBNA1的免疫组织化学。然而，这些针对病毒RNA或蛋白的方法灵敏度欠佳，并且可能由于表达缺乏、抗原修复程序不当、RNA降解、信噪比不足或组织固定或制备问题而产生假阴性结果。因此，即使EBV存在，也可能被遗漏。同样，基于PCR检测的分子方法也引起了对假阴性结果的担忧，因为与EBV DNA的杂交可能因病毒DNA的部分缺失或多态性而受阻。另一方面，PCR可能高估EBV关联性，因为它无法区分感染细胞的类型，或者由于扩增子污染而产生假阳性结果。基于单细胞微滴数字PCR技术与单细胞分离技术和集成微流控设备相结合的一种更特异的方法，可能能够区分肿瘤微环境中的EBV感染恶性细胞。
支持“肇事逃逸”机制的直接实验证据也缺乏。几项历史上试图在原发性EBV相关肿瘤中直接研究“肇事逃逸”假说的研究得出了相互矛盾的结果。这种差异在经典型霍奇金淋巴瘤中尤为明显，儿童和成人病例的发现不同。两项关于成人经典型霍奇金淋巴瘤的独立研究在LMP1阴性或EBV阴性病例中没有发现病毒基因组片段的证据。然而，在儿童经典型霍奇金淋巴瘤中，通过qPCR在一部分EBER阴性肿瘤中检测到EBV。值得注意的是，其中两个肿瘤含有缺陷的EBV，这表明在一些EBV阴性病例中，病毒可能因病毒基因组的缺失而逃避了检测。此外，最近的一项研究报告了两例成人经典型霍奇金淋巴瘤，EBV存在于初始肿瘤中，但在复发的经典型霍奇金淋巴瘤淋巴结活检中不存在。这一发现进一步支持了至少在一部分病例中，EBV可能有助于肿瘤启动，但对于持续的致瘤表型并非必需的可能性。
最近的检测方法发展部分解决了EBV检测的挑战。对超过2500个癌组织的全基因组和全转录组分析发现了比以前报告更多的病毒阳性病例。值得注意的是，EBV成为最常检测到的病毒之一，突显了当前实施的检测方法在识别EBV遗迹方面的局限性。在此背景下，必须考虑到，除了病毒DNA，EBV还编码一个大的微RNA库，主要源自BART和BHRF1区域。这些病毒miRNA在致癌过程和免疫逃逸中发挥着明确的作用，通过调节病毒和宿主基因表达，并且在EBV基因组缺失的情况下可能持续存在或以低水平可检测到。在最近的一项研究中，对EBV阳性和阴性伯基特淋巴瘤样本的miRNA谱分析揭示了原发性伯基特淋巴瘤肿瘤中EBV感染的“踪迹”，其特征是存在EBV miRNA，尽管缺乏EBER表达。为了进一步研究“肇事逃逸”假说，我们的小组采用了一种方法学策略，将高灵敏度与高特异性相结合。该方法应用于更大的伯基特淋巴瘤和其他EBV阴性B细胞淋巴瘤队列，以及相应的伯基特淋巴瘤和经典型霍奇金淋巴瘤细胞系和胃癌。
每种常规和非常规的EBV检测技术都有其内在的优点和局限性。在“肇事逃逸”假说的背景下，主要挑战之一是假阳性结果的风险，尤其是在应用高灵敏度方法时。基于PCR的方法可以检测到极低的病毒拷贝数，但无法区分存在于肿瘤细胞内的EBV序列和肿瘤微环境中的序列。同样，检测EBV编码的微RNA或残留的病毒DNA可能反映了先前感染的遗迹；然而，这些踪迹是否对肿瘤启动具有积极的生物学贡献仍有待确定。为了最大限度地减少误解，支持“肇事逃逸”机制的证据理想上应基于互补方法的整合，包括原位技术、空间分辨分析，以及在可能情况下的单细胞方法。甲基化和突变分析可以进一步支持该假说。需要强调的是，EBV踪迹的存在应谨慎解释，特别是当它们基于单一检测方法时，并评估病毒信号是否持续定位于恶性细胞。在我们的研究中，EBV踪迹的阳性首先通过常规方法检查，然后通过高灵敏度原位方法确认，这些方法在空间上证明了EBV遗迹在一部分肿瘤细胞中的存在。
使用这种精细的检测策略，EBV被识别的频率比以前认为的更高，大约80%的伯基特淋巴瘤、50%的霍奇金淋巴瘤、37%的DLBCL和6%的滤泡性淋巴瘤病例，通过高灵敏度方法在肿瘤细胞中显示出EBV存在的证据。这些发现表明，EBV在早期肿瘤发展中的作用比先前假设的更为广泛。支持这一观点的是，我们对一例DLBCL和两例经典型霍奇金淋巴瘤的分析表明，在疾病初发时EBER-ISH阳性转变为复发时EBER-ISH阴性。此外，我们的小组发现了一例DLBCL，其特征是一个强烈EBER阳性细胞区域与另一个完全阴性的区域分离。重要的是，EBER阳性淋巴瘤及其相应的EBER阴性复发是克隆相关的。这些发现与最近的研究一致，这些研究不仅在EBER原位杂交为EBV阴性的淋巴瘤中检测到病毒踪迹，而且在上皮恶性肿瘤如常被归类为EBV阴性的胃癌中也检测到了病毒踪迹。具体来说，在曼贾特拉及其同事的研究中，分析了最初通过常规技术被认为是EBV阴性的DLBCL病例，使用更灵敏的策略，例如针对EBNA1编码区、LMP1的qPCR、针对重复BamHI W片段的定性PCR，以及针对LMP1和EBNA2转录本的双重View RNA ISH，使得在大约三分之一的病例中检测到病毒踪迹。然而，带有EBV踪迹的病例的免疫应答基因表达谱显示，有病毒遗迹和无病毒遗迹的病例之间没有显著差异。值得注意的是，只有通过常规方法定义的EBV+ DLBCL，在免疫应答基因表达上显示出差异。这可能表明，仅仅存在病毒遗迹可能不足以引发细胞毒性免疫应答，正如EBV阳性淋巴瘤病例中所报告的那样。或者，可能是“肇事逃逸”机制不足以改变局部免疫环境，而需要EBV感染肿瘤细胞的持续存在才能触发此类反应。就我们所知，曼贾特拉等人是第一个评估EBV病毒踪迹与DLBCL中免疫应答标志物存在相关性的研究。然而，EBV踪迹在DLBCL以及其他EBV相关肿瘤发病机制中的作用仍需进一步阐明。
目前，EBV丢失的间接证据可以通过甲基化和突变分析获得。由于EBV启动的致癌事件可能是可遗传的，即使在病毒被消除后也可能持续存在，这些研究可能为先前EBV感染提供见解。然而，在病毒消失后确认EBV对肿瘤发展的贡献仍然具有挑战性。这一观点得到我们对诸如MGMT和CDH1等基因甲基化状态研究的支持，这些基因已知在伯基特淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤和DLBCL中受EBV表观遗传失调。我们的研究显示，含有EBV踪迹的病例显示出与EBV阳性肿瘤相似的甲
