《European Biophysics Journal》：Analysing the structure of antibodies using circular dichroism with an antibody augmented reference set and the algorithm SELCON
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治疗性单克隆抗体(mAb)正确折叠对其效能与安全性至关重要。现有圆二色谱(CD)技术在分析抗体分子时，因缺少合适的、包含类似结构蛋白质光谱的参照集而受到限制。为解决此问题，研究人员开发了一个增强参照集，其中纳入了14种mAbs的CD光谱，并集成了一个免费的Python软件包SSCalcPy-mAb。该研究利用SELCON3算法，不仅能更准确分析抗体二级结构，还能通过算法使用的参照蛋白质列表来评估目标抗体的折叠状态，为生物制药质量控制提供了有力工具。
在生物医药领域，治疗性单克隆抗体（monoclonal antibody, mAb）已占据半壁江山，成为对抗癌症、自身免疫疾病和传染病的利器。如同任何精密武器，其有效性和安全性高度依赖于一个核心属性——正确的三维结构。然而，抗体的生产过程并非一帆风顺，从培养、纯化到最后的制剂，每一步都可能让其结构“变形”，影响疗效甚至引发免疫反应。因此，实时、准确地监控抗体在生产过程中的结构完整性，是生物制药行业面临的关键挑战。
传统的结构分析“神器”——圆二色谱（Circular Dichroism, CD）光谱技术，本应是应对此挑战的理想选择。它快速、无损，能灵敏地“读取”蛋白质在溶液状态下的二级结构信息，如α-螺旋（α-helix）和β-折叠（β-sheet）的含量。但尴尬的是，这项技术在分析抗体时遇到了瓶颈。问题出在其“参考书”——用于比对的蛋白质光谱参照集上。现有的主流参照集，如SP175，虽然收录了多种蛋白质，但专门针对抗体（特别是治疗性人源化抗体）的光谱却凤毛麟角，仅包含一个鼠源免疫球蛋白G。这就好比用一本主要介绍哺乳动物的图鉴去鉴定一种特殊的深海鱼，其准确性自然大打折扣。这种参照集的缺失，严重限制了CD光谱在蓬勃发展的抗体药物质量控制中发挥其应有价值。为了解决这个“有仪器，缺标准”的难题，一组研究人员开展了一项创新研究，他们的成果最终发表在《European Biophysics Journal》上。他们开发并验证了一个专门针对抗体的增强型CD光谱参照集，并将其与强大的分析算法结合，形成了一套评估抗体折叠状态的新工具。
为了达成研究目标，作者团队主要运用了以下关键技术：1. 圆二色谱（CD）光谱学：采集了14种不同治疗性单克隆抗体在远紫外区（低至178纳米）的高质量CD光谱数据。2. 抗体同源建模与二级结构计算：基于已知的抗体结构，为这14种mAbs构建了同源模型，并使用DSSP（Dictionary of Secondary Structure of Proteins）方法精确计算了其螺旋、折叠、转角等二级结构组分的理论比例，作为验证的“金标准”。3. SELCON3算法：采用了一种经过验证的、具有自洽约束的算法，用于从CD光谱数据中反推蛋白质的二级结构组成。4. “留一法”交叉验证：将新构建的包含14个mAbs光谱的增强参照集（SP-mAb178）中的每一个抗体依次“留出”作为测试样本，用其余参照光谱进行分析，以评估方法的准确性和稳健性。5. 软件开发与集成：将新的参照集和分析流程整合进一个名为SSCalcPy-mAb的免费、开源的Python软件包中，便于科研和工业界使用。
研究结果
增强参照集与验证分析表现优异
研究人员将14种治疗性mAb的CD光谱数据添加至修订版SP175参照集中，创建了名为SP-mAb178的新参照集。通过严格的“留一法”交叉验证，他们评估了SELCON3算法结合新参照集在预测抗体二级结构方面的性能。分析结果表明，该方法对“螺旋”含量的预测平均绝对误差优于1%，对“折叠”和“转角”的预测误差在1.5%以内，即使对较难预测的“其他”结构，误差也低于2.5%。如图1所示，预测值与基于同源模型计算的理论值之间差异很小，证明了该方法对于抗体二级结构分析的可靠性和准确性。
算法输出提供额外的折叠状态判别信息
本研究的一个重要创新在于充分利用了SELCON3算法的内部工作机制。与某些随机选择参照蛋白的方法不同，SELCON3会系统性地将待测蛋白的CD光谱与参照集中的所有光谱进行比较，并按照相似度（以均方根偏差RMSD递增排序）列出在计算中实际用到的参照蛋白。分析发现，对于一个折叠良好的抗体，其CD光谱在SP-mAb178参照集中的最佳匹配对象几乎总是其他13个治疗性mAb和原有的那个免疫球蛋白G。相反，当分析一个因低pH处理而代表错误折叠状态的抗体样本时，其最佳匹配列表中频繁出现了许多非抗体类的蛋白质。这为判断一个未知抗体样本是否处于正确折叠状态，提供了除二级结构数据外的另一个强有力的辅助判据。
研究结论与意义
本研究成功地构建并验证了首个专门针对治疗性单克隆抗体的圆二色谱增强参照集SP-mAb178。通过将其与成熟的SELCON3算法集成于SSCalcPy-mAb软件包中，研究建立了一套全新的、双管齐下的抗体折叠状态评估方案。
该方案的意义在于：首先，它显著提升了CD光谱技术分析抗体的准确性。专门化的参照集弥补了现有通用参照集在抗体表征上的不足，使得二级结构定量分析的结果更加可靠，满足了生物制药行业对工艺过程和产品一致性进行精细监控的需求。其次，它引入了基于光谱相似性的折叠状态判别新维度。通过检查SELCON3算法计算时所使用的参照蛋白列表，用户可以获得关于被测抗体光谱“像不像”一个典型良好折叠抗体的直观信息。这为快速区分正确折叠与错误折叠（如聚集、变性）的抗体物种提供了额外的、互补的证据。最后，该研究的产出具有高度的实用性和可及性。所有数据、算法和验证工具均以开源软件包的形式免费提供，极大地降低了生物制药企业和研究机构采用该先进分析方法的技术门槛。
总而言之，这项工作不仅解决了CD光谱在抗体分析中长期存在的参照集短板问题，更通过巧妙的算法应用扩展了其信息维度。它使得CD这一经典技术能更好地服务于现代生物制药的研发与生产质控，为确保每一支抗体药物都保持其设计时应有的、完美的三维结构，增添了一道坚实可靠的技术保障。
