基于拉曼光谱技术的mRNA体外转录实时监控及其在生物制造中的应用

《Biotechnology and Bioengineering》：Real-Time Monitoring of In Vitro Transcription for Production of mRNA Using Raman Spectroscopy

本研究致力于解决mRNA生产过程中，体外转录（IVT）反应缺乏有效实时监控工具的关键挑战。研究团队利用拉曼光谱结合偏最小二乘回归（PLS）分析，首次实现了对ATP、CTP、GTP、UTP和mRNA浓度的同步、在线监测。结果表明，该方法的预测准确性与传统离线分析相当（R20.82–0.99，相对误差4%–13%），并展现了不依赖mRNA序列的普适性预测能力，为mRNA制造的实时过程分析、连续生产和自动化控制（Pharma 4.0）提供了强有力的技术支持。

　　

mRNA（信使核糖核酸）疫苗在抗击新冠疫情中取得的巨大成功，向世界展示了这一技术平台“即插即用”、响应迅速的变革性潜力。然而，尽管相较于传统的细胞培养或鸡胚生产方式，mRNA疫苗的研发和生产速度更快，但其制造过程中仍存在严峻挑战。其中，用于体外转录（IVT）的原材料成本高昂，并且目前缺乏对该关键反应步骤进行实时监控的有效方法。传统的离线分析方法，如基于荧光的检测（RiboGreen）或高效液相色谱（HPLC），通常需要数十分钟甚至数小时才能获得结果，这与通常仅持续约2小时的IVT反应时间完全不匹配。这种监控的滞后，不仅无法及时发现和纠正生产中的问题，也难以实现基于实时数据的精确补料或连续化生产，从而制约了生产效率的提升和成本的降低。为了解决这一瓶颈，推动mRNA制造向自动化、智能化的Pharma 4.0时代迈进，研究人员将目光投向了过程分析技术（PAT）中的光谱学方法。

为此，研究团队在《Biotechnology and Bioengineering》上发表了一项开创性研究，探索并验证了使用拉曼光谱（Raman Spectroscopy）对mRNA的IVT过程进行实时、在线监控的可行性。这项研究旨在回答一个核心问题：能否在不干扰反应的前提下，通过一种快速、非侵入式的技术，同时监控反应物（四种核苷酸三磷酸，NTPs）的消耗和产物（mRNA）的生成，并实现跨不同mRNA序列的通用性预测？

为开展此项研究，作者主要运用了以下几个关键技术方法：首先，在小型搅拌罐生物反应器中进行了多种mRNA构建体（编码GFP、荧光素酶和SARS-CoV-2 Spike蛋白）的IVT反应。其次，利用集成的拉曼光谱探针，以每分钟一次的频率在线采集反应体系的拉曼光谱信号。第三，通过标准的离线分析方法（RiboGreen荧光法和高性能液相色谱法HPLC）对采集的反应样本进行mRNA和四种NTP（ATP, CTP, GTP, UTP）的浓度测定，作为建模的“金标准”参考值。最后，运用化学计量学中的偏最小二乘回归（PLS-R）方法，将预处理后的拉曼光谱数据与离线测量的浓度值进行关联，建立预测模型，并评估其校准、交叉验证及对独立验证批次（包括不同产率和不同序列的mRNA生产）的预测性能。

3.1 模型开发与监控

研究人员建立了针对ATP、CTP、GTP、UTP和mRNA浓度的PLS回归模型。校准和交叉验证结果显示模型预测值与离线测量值高度吻合，决定系数（R²Y和Q²）均高于0.99，且没有明显的过拟合迹象。当将训练好的模型应用于一个高产率和一个低产率的独立验证批次时，拉曼光谱成功地捕捉到了NTP消耗和RNA生成的预期动力学趋势。预测的R²值在0.82至0.96之间，相对误差为4%至13%，这与参考的离线分析方法本身的误差（10%-12%）相当甚至更优，证明了该实时监控方法的可靠性。

3.2 光谱数据分析

通过对用于建模的预处理拉曼光谱进行分析，研究人员发现光谱变化与RNA浓度相关，并且与模型中的变量重要性投影（VIP）高分区域相符。有趣的是，四种NTP在光谱上显示出相似的重要区域而非独特的指纹，但将补料分批（fed-batch）运行的数据纳入模型后，NTP与RNA的VIP谱图得到了更清晰的区分，强调了训练数据设计对模型特异性的重要性。

3.3 模型在不同RNA序列上的应用

一个关键发现是，该监控方法具有不依赖序列的预测能力。研究人员使用仅基于一种mRNA序列（荧光素酶）生产数据训练的模型，去预测另外两种完全不同序列（GFP和Spike）mRNA的生产浓度，结果依然准确，相对误差低于10%。这表明，在引入新的mRNA产品时，可能无需为每种序列重新校准模型，极大地节省了工艺开发时间。此外，通过分析不同序列但实验条件相同的批次数据，研究还识别出了与RNA序列差异更相关或与总RNA浓度更相关的特定拉曼位移波长区域。例如，与序列更相关的区域（如770， 1140， 1380 cm^-1）多与特定核苷酸相关，而与浓度更相关的区域（如828， 980， 1107 cm^-1）则多与RNA磷酸骨架和磷酸副产物相关。

结论与讨论

本研究成功论证了使用拉曼光谱结合多元统计分析，对mRNA IVT过程进行实时、在线监控的可行性。该方法能够同步、准确地预测所有四种NTP和mRNA的浓度，其预测误差与金标准离线方法相当。更重要的是，研究证明了基于一种mRNA序列建立的模型，能够有效预测其他序列的mRNA浓度，这为快速切换生产不同mRNA产品、无需繁琐的模型重建提供了可能，尤其在应对 pandemic 等需要快速响应的场景中意义重大。

这项工作的意义深远。首先，它提供了一种快速（每分钟）、非侵入式、可集成的实时监控解决方案，能够减少人工采样和离线分析，实现更密集的时间点监控，并有助于早期发现和终止有问题的批次。其次，实时追踪NTP消耗为实现补料分批或连续化生产的先进过程控制奠定了技术基础，有望提高昂贵原料的利用效率。此外，该技术是迈向FDA倡导的Pharma 4.0框架、实现实时放行和数字化孪生的关键支柱。

尽管拉曼监控依赖于复杂的多元模型和对高质量训练数据集的精心设计，但其多功能性也预示了广阔的应用前景。除了监控浓度，未来通过构建适当的模型，拉曼光谱还有望用于实时监控其他关键质量属性，如加帽效率、polyA尾长分布、双链RNA（dsRNA）含量等，从而成为一个强大的“一体化”过程分析工具。总之，这项研究为mRNA制造的先进过程分析技术发展迈出了重要的第一步，将有力支持全球mRNA制造能力的提升、生产成本的优化，并最终促进疫苗的公平可及和全球大流行防范能力的建设。