气相色谱-串联质谱法结合离子对固相萃取和原位甲基化技术测定草药食品配方中的双酚类物质

《Journal of Chromatography A》：Gas Chromatography – Tandem Mass Spectrometric Determination of Bisphenols from Herbal Food Formulations by Ion-pair Solid-phase Extraction and in-situ Methylation Method

双酚类化合物作为内分泌干扰物，在草药食品中痕量检测面临极性大、峰形差等问题。本研究开发离子对固相萃取联合GC-MS/MS在 situ 甲基化新方法，使用TMPAH实现非腐蚀性甲基化，线性范围1-5000 ng/g（R2＞0.99），加标回收率95-105%，精密度＜15%。该技术解决了传统衍生化柱腐蚀问题，为Ayush制剂安全评估提供高效手段。

　　

Nagaraju Maddala | Rama Krishna Maloth | Satya Sri Dharmika Kanakala | Sai Krishna Ganji | Swarajya Lakshmi Vattem Venkata | Vijayasarathi Venkata Ramana Upadhyayula

质谱中心，分析与结构化学系，CSIR-印度化学技术研究所，Uppal Road，Tarnaka，海得拉巴，特伦甘纳邦，印度 500007

摘要

双酚类物质是一类重要的内分泌干扰化学物质（EDC），它们能够模仿人体内分泌系统，导致激素功能障碍。在本研究中，我们开发并验证了一种离子对固相萃取（SPE）方法，随后通过原位甲基化和气相色谱-串联质谱（GC-MS/MS）技术来检测草药食品配方中的13种双酚类物质。该方法将分析物在GC进样口转化为甲基醚，从而获得更好的峰形并提高检测灵敏度。该方法在1至5000 ng/g的范围内表现出线性关系，R2值大于0.99。在25、250和2500 ng/g三个浓度水平下，日内和日间精度均低于15%。从草药食品中回收的分析物含量在95%到105%之间，且在这些浓度水平下基质效应小于10%。

引言

双酚类物质是常用的合成化学物质，常用于聚合物（如聚碳酸酯）中以增加其刚性。据报道，双酚A（BPA）是产量最大的双酚类物质之一，被广泛用于制造坚固的塑料[[1], [2], [3], [4]]。根据国际标准，饮用水中BPA的最大允许浓度为2.5 μg/mL（https://eur-lex.europa.eu）。因此，BPA在塑料中的使用受到了限制；然而，新一代双酚类物质（如BP-F和BP-S）已被引入作为BPA的替代品[[5], [6], [7], [8], [9], [10]]。双酚类物质在塑料包装材料中的使用一直是一个主要问题，因此必须对其在食品和药品中的存在进行严格监测。印度是传统天然药物的丰富来源，各种草药配方的效果已在阿育吠陀等古代文献中有所记载，许多相关研究也在国内外发表。许多配方被用于治疗疾病，有些则用于增强免疫力。这些配方通常是通过提取、混合、煮沸、燃烧、炭化等多种复杂工艺从天然植物中制备的。这些产品通常装在硬质塑料容器中，由于大多数草药制剂含有天然脂肪，因此容易从容器中吸收邻苯二甲酸盐和双酚类等疏水性化学物质，从而存在污染风险。因此，有必要开发一种方法来监测阿育吠陀制剂中的内分泌干扰双酚类物质含量。

已有多项研究报道双酚类物质存在于各种产品中，包括包装饮用水[[11], [12], [13], [14], [15], [16]]、食品样品[7,12,17]、饮料[12,16]、超加工食品[[18], [19], [20], [21]]、罐装牛奶产品[22]、植物油[[23], [24], [25], [26]]、鱼类产品[27,28]以及塑料容器[29,30]中。双酚类物质的定量通常采用基于液相色谱的分析技术，如高效液相色谱（HPLC）和超高效液相色谱（UPLC）系统（连接光电二极管阵列（PDA）和紫外（UV）检测器[29,30]），以及质谱系统（LC-MS）[15,22]。在经过充分样品处理和衍生化处理后，也有使用GC-MS技术进行双酚类物质定量研究的报道[[31], [32], [33], [34], [35], [36]]。双酚类物质属于极性化合物，含有羟基，因此在与固定相的结合过程中峰形较差。为了提高GC-MS系统的检测灵敏度，需要对分析物进行衍生化处理。三甲基硅烷化（TMS）[37,38]和丹酰化[39,40]是最常用的双酚类物质衍生化方法。然而，由于TMS衍生物的不稳定性，使用不同的硅烷化试剂时结果并不一致。此外，过量使用TMS试剂会缩短分析柱的寿命。因此，与腐蚀性衍生化试剂相比，使用安全的衍生化方法对双酚类物质的灵敏分析更为有利。对于环境和食品基质中的酸性残留物（如烷基膦酸和有机酸），原位衍生化方法（使用碱性离子对试剂）是一种良好的替代方案[[41], [42], [43], [44]]。双酚类物质本身也具有酸性，可以使用合适的离子对甲基化试剂（如三甲基苯胺氢氧化物（TMPAH）进行烷基化。这种技术可以作为双酚类物质甲基化的替代方法，且对分析柱的损害较小。

在本研究中，我们开发了一种简单且灵敏的离子对固相萃取方法，随后进行原位甲基化处理，使用TMPAH试剂从草药食品配方样品中检测双酚类物质，并通过GC-MS/MS技术进行定量。该方法按照ICH Q2R1指南进行了验证，并应用于阿育吠陀食品补充剂的分析。

材料

本研究中使用的双酚类物质包括：双酚A、双酚F、双酚S、双酚E、双酚C、双酚G、双酚M、双酚P、双酚AF、双酚AP、双酚FL、双酚PH和双酚TMC，均购自Dr. Erhenstorpher标准品（德国奥格斯堡）。三甲基苯胺氢氧化物（TMPAH）和邻甲苯酸（OTA）购自Sigma Aldrich（印度孟买E-merck）。所使用的溶剂为ULCMS级甲醇和乙腈，以及HPLC级溶剂。

双酚类物质的甲基化方法开发

之前已有报道使用GC-MS系统进样口中的离子对试剂对酸性分析物进行衍生化的方法[42,43,45]。这些衍生化方法（如使用四烷基胺氢氧化物进行丁基化和甲基化）对酸性分析物具有非腐蚀性。由于双酚类物质会形成酚氧阴离子，因此采用了类似的方法，利用TMPAH实现对双酚类物质的非腐蚀性和灵敏检测。

结论

我们开发了一种简单、高效、灵敏且选择性的甲基化方法，用于检测草药食品配方中的双酚类物质。甲基化使用的是季铵离子对试剂——三甲基苯胺氢氧化物，该试剂具有非腐蚀性，不会影响分析物的洗脱时间。分析物使用疏水性溶剂进行提取，这种溶剂优先提取疏水性物质。

CRediT作者贡献声明

Nagaraju Maddala：验证、实验研究、数据分析。Rama Krishna Maloth：数据管理。Satya Sri Dharmika Kanakala：软件开发。Sai Krishna Ganji：数据可视化、资源协调。Swarajya Lakshmi Vattem Venkata：项目监督、实验指导。Vijayasarathi Venkata Ramana Upadhyayula：论文撰写与审稿、项目管理、资金筹集、概念构思。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能影响本文研究的财务利益或个人关系。

致谢

第一作者感谢科学和工业研究委员会（CSIR）提供的奖学金。作者衷心感谢CSIR-IICT主任为这项研究工作提供的财政支持和设施。