《Journal of Chromatography A》：High-Throughput mRNA Poly(A) Tail Characterization Through On-Off Retention Ion-Exchange Chromatography
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mRNA疗法的质量控制和纯度分析面临色谱分辨率低的问题，本研究通过离子交换色谱（IEX）的盐位移效应，发现5厘米超短柱即可实现高效分离。创新性提出线性离子强度（LIS）模型，结合等梯度与非线性梯度，成功分离长度差异仅1 nucleotide的poly(A)尾（117nt和118nt），并实现6.5分钟内eGFP和Fluc mRNA的定量分析。该技术突破传统IEX长柱限制，为高通量mRNA质量评估提供了新方法。
Christine Vo|Raymond Lieu|Yuchen Fan|Kelly Zhang|Tao Chen|Wan-Chih Su
合成分子分析化学，基因泰克公司（Genentech Inc.），1 DNA Way，南旧金山，加利福尼亚州 94080，美国
摘要
大型核酸的色谱分辨率有限，这仍然是开发用于mRNA治疗的高通量分析平台的主要瓶颈。在这里，我们报告了在强离子交换（IEX）条件下寡核苷酸和mRNA的显著盐置换敏感性，并使用标准化的线性离子强度模型重新定义了溶剂强度的缩放。在系统研究了流动相pH值和柱温的影响后，我们确定寡核苷酸和mRNA的有效柱长（Leff）小于5厘米，从而能够在超短柱上实现快速分离。利用这种开关式洗脱行为，我们开发了两种互补的高通量IEX方法，使用5厘米的柱子在统一的平台上操作（pH 8，75°C，高氯酸锂作为流动相添加剂）。6.5分钟的梯度实现了eGFP和Fluc mRNA的非poly(A)和poly(A)物种的基线分离和定量。为了在寡核苷酸序列范围内分离poly(A)长度变体，非线性对数梯度在4分钟内实现了20-120 nt poly(A)梯度的分离，从而能够高通量地确定poly(A)尾长。经过一步RNase T1消化后，分别确定了eGFP和Fluc mRNA的poly(A)尾长为117 nt和118 nt，与理论值一致。总体而言，这项工作确立了开关式洗脱行为作为IEX中的定义性保留机制，并证明了其作为高通量表征mRNA poly(A)含量和尾长的强大策略，具有支持mRNA治疗药物工艺开发和质量控制的巨大潜力。
引言
基于mRNA的治疗药物已成为广泛治疗应用中的变革性模式，涵盖了遗传疾病、传染病和癌症等领域，COVID-19疫苗的成功就是一个例证[1,2]。治疗性mRNA的质量和有效性在很大程度上取决于序列工程、化学修饰和高级结构优化的精确控制[3,4]。鉴于mRNA构建的多样性以及优化序列和制造条件的需求，高通量分析工具对于快速评估至关重要。影响mRNA转录本稳定性和翻译效率的一个关键因素是3’端附加的poly(A)的存在和长度[5]。然而，通常会引入与poly(A)相关的杂质，包括无尾转录本和异质或错误的poly(A)长度[4,6]。目前的分析平台，包括毛细管凝胶电泳（CGE）[7],[8],[9],[10]、离子对反相液相色谱（IP-RPLC）[6,[10],[11],[12],[13]、亲水相互作用液相色谱（HILIC）[14,15]和尺寸排阻色谱（SEC）[13,16]，已被广泛用于评估mRNA的纯度、大小分布、poly(A)尾长和结构完整性。尽管这些方法有效，但它们通常需要大量的样品制备，并且对于大型核酸（尤其是那些具有密切相关序列变体的核酸）来说，通量有限且分辨率不足[4]。相比之下，离子交换色谱（IEX）基于表面电荷密度和核苷酸长度实现接近天然状态的分离[17]，无需使用离子对试剂即可区分全长和截短物种[4]。然而，传统的IEX方法通常依赖于长柱（≥10厘米）和延长的梯度，这限制了通量并减缓了方法的发展[18]。
最近的研究表明，大型生物分子（如mRNA和蛋白质）在液相色谱中可以表现出独特的开关式保留行为，其中流动相组成的微小变化会触发从完全保留到完全洗脱的快速转变[19]。这里的“开关式”一词遵循了之前在大生物分子LC研究中使用的操作定义，指的是保留敏感性（S）足够高，以至于分析物仅利用柱子的一小部分有效长度，尽管这一过程在数学上不是不连续的阶跃函数。Tsalmpouris等人最近在IEX中利用这一原理引入了一个等度洗脱步骤，以分离mRNA物种而不会导致峰宽化[20]。对于蛋白质，这种行为已在线性溶剂强度（LSS）模型中得到描述，并被用来证明在RPLC和IEX中使用超短柱子的合理性[19],[21],[22],[23]，因为只有柱子的一小部分参与保留，而剩余的部分没有贡献。然而，寡核苷酸在其延长的主链上带有均匀的负电荷，并采用线性构象，与蛋白质不同，因此尚不确定蛋白质的IEX行为是否适用于寡核苷酸，需要进一步研究。Guillarme等人证明，IP-RPLC中的寡核苷酸遵循相同的结合-洗脱机制，其特征是高溶剂强度（S）参数，反映了其对流动相强度的高保留敏感性[24]。尽管取得了这些进展，但由于需要将溶剂强度参数标准化以实现不同色谱模式下的S值的无量纲可比性，因此对IEX条件下寡核苷酸的高灵敏度保留的确定和系统研究受到了阻碍[25]。这一要求源于流动相的差异：RPLC中使用的有机溶剂比例（φ）是无量纲的，而IEX保留则由盐浓度（C）控制，具有单位。因此，建立一种标准化的、无量纲的坐标对于有意义的缩放和比较是必要的。因此，IEX中寡核苷酸的有效柱长尚未被定义。
在这项研究中，我们首次通过引入线性离子强度（LIS）模型报告了IEX条件下寡核苷酸的开关式洗脱行为，该模型实现了跨色谱模式的无量纲溶剂强度参数标准化。为了将这一基本见解转化为实用的高通量IEX工作流程，我们建立了两组标准：带有和不带有poly(A)尾部的poly(A)梯度和完整的mRNA（eGFP和Fluc）。基于poly(A)梯度和完整mRNA观察到的高离子置换敏感性，我们使用超短（5厘米）柱子开发了两种互补的高通量IEX方法，用于（1）定量poly(A)和非poly(A)mRNA含量，以及（2）确定poly(A)尾长。值得注意的是，该工作流程不仅实现了仅相差120个核苷酸的poly(A)和非poly(A)mRNA物种的基线分离，而且还能够以高通量方式快速确定mRNA的poly(A)尾长。总之，这些结果确立了IEX作为mRNA表征的多功能高通量平台。
章节片段
化学品和试剂
LC/MS级水和Tris-EDTA（TE）缓冲液（20×，无RNase）从Fisher Scientific（美国新罕布什尔州）购买。盐酸（1.0 N）、氢氧化钠（1.0 N）、无水高氯酸锂（LiClO?）、无RNase的水、RNase T1（1000 U/μL）、Dynabeads? Oligo(dT)25磁珠以及Dynabeads? mRNA纯化试剂盒（包括Tris-HCl洗脱缓冲液、洗涤缓冲液B和裂解/结合缓冲液）从Thermo Fisher Scientific（美国马萨诸塞州）购买。无水高氯酸锂（NaClO4）离子交换色谱中开关式保留行为的评估
要将IP-RPLC中建立的开关式保留原理扩展到IEX，必须解决两个关键挑战。首先，尚未通过LSS框架彻底验证核酸在盐梯度条件下的洗脱行为。其次，需要标准化无量纲参数S，以便在不同色谱模式和条件下进行有意义的比较。
结论
在这项研究中，我们首次报告了IEX中寡核苷酸的开关式保留行为，并彻底研究了这种定义性的色谱机制，适用于寡核苷酸和mRNA。通过应用LSS框架的无量纲适应版本，即LIS模型，我们发现mRNA和poly(A)寡核苷酸的有效柱长小于5厘米。我们开发了两种互补的高通量IEX方法，用于（1）定量poly(A)含量和（2）确定poly(A)尾长。
作者贡献
Christine Vo：概念化、数据管理、正式分析、研究、方法论、验证、可视化、撰写初稿、撰写审查和编辑
Raymond Lieu：方法论、研究、验证、撰写审查和编辑
Yuchen Fan：研究、监督、验证、撰写审查和编辑
Kelly Zhang：研究、监督、撰写审查和编辑
Tao Chen：概念化、方法论、监督、验证、撰写审查和编辑
利益冲突
作者声明他们在本文所述的工作中没有财务或个人利益冲突。所有作者在研究进行时都是基因泰克公司的员工。
致谢
我们衷心感谢Waters公司的Szabolcs Fekete、Matthew Lauber和Kennedy Sawyer在合作中的宝贵贡献、富有洞察力的讨论、提供原型超短柱子以及在修订过程中的支持。我们还要深深感谢NanoChrom Technologies的Xiaodong Liu、Xuefei Sun和Yongmei Zhang在初步实验开发中的贡献以及宝贵的科学讨论。最后，我们还要感谢Bingchuan Wei
CRediT作者贡献声明
Christine Vo：撰写 – 审查与编辑、撰写初稿、可视化、验证、方法论、研究、正式分析、数据管理、概念化。Raymond Lieu：撰写 – 审查与编辑、可视化、验证、方法论。Yuchen Fan：撰写 – 审查与编辑、验证、监督、研究。Kelly Zhang：撰写 – 审查与编辑、监督、研究。Tao Chen：撰写 – 审查与编辑、验证、监督、方法论、概念化。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能影响本文所述工作的财务或个人利益冲突。
