《Xenotransplantation》：Expression of Human Thrombomodulin Prevents Early Thrombocytopenia and Thrombotic Microangiopathy in Pig-to-Nonhuman Primate Orthotopic Liver Xenotransplantation
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本研究针对猪-非人灵长类肝异种移植(LXT)模型中严重的早期血小板减少症和凝血功能障碍等主要生存障碍，开展了携带五种基因修饰（GTKO/CMAHKO/β4GalNT2KO/hCD55/hTBM）的供体猪肝原位移植研究。结果表明，供肝中人血栓调节蛋白(hTBM)的高表达有效预防了快速严重血小板减少症，受者无需输血且未发生血栓性微血管病(TMA)。该研究为通过优化供体基因修饰和凝血因子替代策略，以克服肝异种移植凝血障碍提供了关键依据。
想象一下，如果能用经过基因编辑的猪的肝脏，来挽救成千上万因等不到人源供肝而濒临死亡的患者，这将是医学领域的巨大突破。然而，从猪到人，尤其是肝脏的异种移植之路，比心脏和肾脏移植更为坎坷。其中一个巨大的“拦路虎”就是严重的、快速的凝血功能紊乱：移植后，受者的血小板会急剧下降，同时可能在微血管中形成广泛的血栓，导致致命的出血或器官损伤。这种被称为“消耗性凝血病”的现象，严重限制了受者的生存时间，是猪-非人灵字类肝异种移植模型走向临床必须攻克的核心难题。
为了直面这一挑战，以Zhongzhou Si和Haizhi Qi为核心的研究团队开展了一项探索性研究。他们想知道，如果给供体猪的肝脏进行一系列“基因升级”，特别是让它高表达一种对人类凝血平衡至关重要的蛋白质——人血栓调节蛋白(hTBM)，能否“安抚”受者混乱的凝血系统，从而跨越早期生存障碍？这项研究成果最终发表在专业期刊《Xenotransplantation》上。
研究人员采用了几个关键的技术方法来探索这个问题。首先，他们使用了经过五种基因修饰的巴马小型猪作为供体，其基因型通过流式细胞术和移植后免疫荧光染色进行了验证。其次，研究在四只西藏猕猴中实施了严格的原位肝移植手术，并采用了两种略有差异的常规免疫抑制方案进行术后管理。通过纵向监测，研究人员系统收集了移植后受者的血液样本，用于分析肝功能、凝血参数、血小板计数以及各类凝血因子活性。同时，利用Sonoclot凝血功能分析仪对一名受者进行了凝血动力学的动态评估。最后，通过对移植肝及受体多器官进行组织病理学、免疫组织化学染色，深入探究了排斥反应和损伤的机制。
3.1 供体基因修饰、围手术期管理策略及受者结局
供体猪的主动脉内皮细胞(PAECs)和移植肝组织检测证实，三种主要异种抗原基因（GGTA1, CMAH, β4GalNT2）被成功敲除，而人CD55(hCD55)和hTBM实现了稳健表达。受者的中位生存时间为5天，主要死因为多器官功能障碍综合征(MODS)，而非以往研究中常见的致命性大出血。
3.2 早期肝功能得以保留，随后出现进行性损伤
除一名因手术并发症导致持续高转氨酶的受者外，其余受者的丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)均呈现先升高、部分恢复、后再升高的双相模式。血清总胆红素(TBIL)变化与之平行。胆汁分泌在术后48小时内达到峰值后下降。血乳酸水平在术后前4天保持稳定低位，显示代谢功能得以保留。血清总蛋白(TP)和白蛋白(ALB)初期稳定，后期随移植物功能障碍而下降。
3.3 无需输血即预防了严重血小板减少症和凝血功能紊乱
与既往研究不同，快速严重的血小板减少症并未发生。四分之三的受者血小板计数维持在>100 × 109/L，且无需输注血小板。国际标准化比值(INR)、凝血酶原时间(PT)和活化部分凝血活酶时间(APTT)维持在可接受范围，血浆纤维蛋白原(FIB)水平持续升高。术后未观察到自发性出血，红细胞(RBC)计数和血细胞比容(HCT)保持稳定。
3.4 人凝血酶原复合物(hPCC)改善了凝血和血小板功能
通过Sonoclot分析发现，一名受者术后早期存在高凝状态，随后恢复正常。在因操作失误导致大出血并接受输血后，其活化凝血时间(ACT)延长，凝血速率(CR)和血小板功能(PF)下降，显示凝血病恶化。值得注意的是，输血虽暂时提升了HCT和血小板计数，却加剧了血小板功能障碍。相反，针对性的hPCC输注有效恢复了凝血和血小板功能。
3.5 猪肝未能持续合成功能性的凝血因子II、蛋白C和蛋白S
基线检测显示，供体猪的凝血因子II(FII)活性与非人灵长类相当，但蛋白C(PC)和蛋白S(PS)活性显著更低，且几乎检测不到FVIII、FIX、FXI活性。移植后，受者体内大部分凝血因子活性初期升高，表明猪肝具有合成功能。然而，FII、PC和PS活性持续下降，反映了持续的合成缺陷。后期其他因子活性也随之下降，与移植物功能障碍相关。
3.6 血栓性微血管病(TMA)和出血缺如，组织结构得以保存
再灌注后2小时，移植物肝小叶结构完整，仅见轻微坏死。尸检时可见局灶性中央小叶坏死，但整体结构得以保存。关键的是，在移植物和受体器官中均未检测到TMA或出血迹象。
3.7 免疫介导的损伤导致进行性功能障碍和生存期缩短
3.7.1 抗体介导的排斥反应(AMR)
尽管采用了三重基因敲除(TKO)供体并使用了眼镜蛇毒因子(CVF)，但移植肝血管内早在再灌注2小时后即出现显著的IgM/IgG沉积，并在尸检时持续存在。补体C4水平下降、移植物内强烈的C4b沉积以及抗TKO抗体(IgM/IgG)水平升高，均证实了补体激活。猪血管性血友病因子(pvWF)表达上调进一步提示内皮损伤。
3.7.2 细胞性排斥
尽管使用了抗胸腺细胞球蛋白(ATG)诱导，但后期淋巴细胞计数反弹。尸检时，大多数受者移植物中出现了CD3+ T细胞浸润，符合迟发性T细胞介导排斥反应(TCMR)。同时，受体来源的CD68+巨噬细胞和CD11b+髓系细胞广泛浸润坏死区域，表明天然免疫激活在移植物损伤中扮演重要角色。
这项研究得出的核心结论是，携带GTKO/CMAHKO/β4GalNT2KO/hCD55/hTBM这五种基因修饰的猪肝，在移植到非人灵长类体内后，能够有效预防早期致命的凝血功能障碍，包括快速严重的血小板减少症、自发性出血和血栓性微血管病(TMA)。这主要归功于供肝高表达的人血栓调节蛋白(hTBM)对受者凝血系统的调控作用。然而，研究的成功是有限度的。长期的生存依然被两大障碍所限制：一是跨物种的凝血因子合成不兼容，猪肝无法持续为受者合成功能性的关键凝血因子（如FII、PC、PS），导致进行性凝血病；二是尽管进行了基因修饰和强效免疫抑制，抗体介导的排斥反应(AMR)以及随后的T细胞和天然免疫反应仍然被激活，最终导致了进行性的移植物功能障碍和衰竭。
在讨论部分，作者将本研究置于肝异种移植发展的历史脉络中，强调了与猪心、猪肾移植相比，肝移植面临的凝血挑战尤为严峻。他们详细探讨了hTBM可能的作用机制，包括通过促进蛋白C激活来抑制凝血，从而间接保护血小板不被过度消耗。研究还对比了靶向补充凝血因子(hPCC)与输注全血的不同效果，指出前者更能针对性地纠正凝血紊乱，而后者可能因引入更多免疫因素而加重内皮激活和消耗性凝血病。对于免疫排斥，作者分析了即使采用TKO供体，AMR依然发生的原因，可能在于残留的或新型的异种抗原（如假设的“第四抗原”），或免疫抑制方案未能完全阻止新生抗体反应。
总之，这项研究的重要意义在于，它首次在体内实验中明确证实，通过基因工程使供肝高表达hTBM，是克服猪-非人灵长类肝异种移植早期凝血障碍的有效策略，为将该技术推向临床扫清了一个关键障碍。同时，它也清晰地揭示了未来需要攻坚的方向：必须进一步优化供体的基因修饰组合（可能需添加更多人类凝血相关基因），设计更有效的免疫抑制方案以控制慢性排斥，并建立针对性的凝血因子替代治疗策略。尽管受限于样本量小和观察期短，这项研究为理解肝异种移植失败机制和规划未来优化路径提供了至关重要的见解和框架。
