《Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis》：First enantioselective determination of N-ethylpentedrone and its major phase-1 metabolites using supercritical fluid chromatography coupled with tandem mass spectrometry and its application to human oral fluid and urine samples
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超临界流体色谱-串联质谱法可有效分离并检测合成卡廷酮及其极性代谢物，通过优化手性色谱柱和流动相 composition解决了传统HPLC法稳定性差的问题，验证了该方法在人类体液样本分析中的适用性，为法医毒理学提供了绿色高效的新工具。
Saba Jorbenadze | Aluda Tchelidze | Giorgia Sprega | Vazha Tkemaladze | Gizo Dolidze | Adele Minutillo | Magi Farré | Lourdes Poyatos | Esther Papaseit | Giuseppe Basile | Tivadar Farkas | Francesco Paolo Busardo | Bezhan Chankvetadze
格鲁吉亚第比利斯国立大学精确与自然科学学院物理与分析化学研究所，I. Chavchavadze大道1号，0179第比利斯
摘要
合成卡西酮类化合物及其代谢物的对映选择性生物分析在分析上仍然具有挑战性。由于这些化合物的碱性特性，在高效液相色谱（HPLC）分析中更倾向于使用高pH值的流动相。然而，最近的研究表明，卡西酮衍生物在高pH值下具有化学和立体化学上的不稳定性。作为HPLC的替代方法，本研究开发了一种超临界流体色谱-串联质谱（SFC-MS/MS）技术，以实现N-乙基戊二酮（NEP）及其主要第一相代谢物的手性分离和检测。通过仔细选择手性柱和流动相组成，成功地实现了母体化合物及其极性代谢物的有效保留和立体选择性分离。该方法的应用通过分析真实的人体口腔液（OF）和尿液样本得到了验证。本研究的结果凸显了SFC-MS/MS在手性代谢物分析方面的扩展潜力，并证明了其作为法医毒理学中HPLC补充分析工具的价值，特别是在新精神活性物质的研究中。
引言
历史上，超临界流体色谱（SFC）并不被认为是分析高极性和可电离化合物的合适技术。早期SFC的应用主要集中在非极性到中等极性化合物上，而高极性化合物的保留效果较差[1]。因此，反相液相色谱（RP-LC）和亲水相互作用液相色谱（HILIC）成为极性小分子的主要分离技术。
在过去十年中，特别是SFC与串联质谱（SFC-MS/MS）结合的技术，在制药、环境、代谢组学和法医毒理学实验室中得到了广泛应用。超高效SFC（UHPSFC）仪器的改进、更多固定相的选择以及对手性相改性剂/添加剂效应的深入理解，显著拓宽了该技术的应用范围，使其能够成功分析更广泛极性范围内的目标化合物。多项综述和比较研究表明，SFC在极性化合物分析中的应用迅速增加[2]、[3]、[4]、[5]、[6]、[7]、[8]、[9]。
流动相组成的优化，包括使用极性有机溶剂作为改性剂并严格控制水分含量和挥发性添加剂，以及先进固定相的开发，显著提高了极性分析物的保留能力、选择性和峰形[3]、[4]、[5]、[6]、[7]、[9]。
RP-LC的这一局限性在处理高极性的第一相代谢物（尤其是第二相代谢物，如羟基、羧基或葡萄糖醛酸酯代谢物）时尤为明显，这些代谢物可能在接近C18柱死体积时洗脱，导致保留效果差、基质效应显著，从而影响定量分析[2]、[5]。尽管HILIC可能对这些化合物有更好的保留效果，但其柱平衡时间较长，对样品溶剂组成敏感，且保留机制复杂，这限制了其在常规法医应用中的可靠性[2]、[10]。相比之下，SFC提供了更快的分析时间、更好的选择性和更低的有机溶剂消耗。
合成卡西酮类化合物是一类特别具有挑战性的色谱分析对象。这些β-酮苯乙胺衍生物具有中等至高极性，并会发生广泛的生物转化，产生的代谢物通常比母体化合物更具极性[11]、[12]、[13]、[14]。N-乙基戊二酮（NEP）是一种典型的合成卡西酮，也属于新型精神活性物质，体现了这些挑战。
合成卡西酮类化合物的另一个关键分析特点是它们的碱性和高pKa值。在HPLC-MS/MS中，为了确保足够的保留效果和对映体分离，通常需要使用高pH值的流动相（例如pH约为10–11的碳酸氢铵缓冲液）[15]、[16]、[17]、[18]、[19]。然而，这种强碱性条件可能会影响合成卡西酮的化学和立体化学稳定性，因为它们在高pH值下容易发生降解和外消旋[17]、[18]、[19]。相比之下，SFC通常使用超临界CO?和有机溶剂（如甲醇（MeOH）、乙醇（EtOH）、丙-2-醇（IPA）或乙腈（ACN）以及低浓度的挥发性添加剂作为流动相，从而形成较为温和的化学环境。这种条件更适用于合成卡西酮及其代谢物，既能保持它们的化学和立体化学特性，又能实现高效的对映体分离和更好的保留效果。此外，SFC相比HPLC还具有更环保的特性、更高的流速（从而加快分析速度）、更高的效率和更低的运营成本[20]、[21]、[22]。
在我们最近的工作中，开发并验证了一种用于测定人体口腔液和尿液中NEP及其第一相代谢物的对映选择性LC-MS/MS方法[19]。在此基础上，本研究旨在展示SFC-MS/MS作为法医毒理学中分析合成卡西酮及其极性代谢物的强大补充工具的潜力。
材料
外消旋NEP盐酸盐参考标准品由Cayman Chemical（美国密歇根州安娜堡）提供。由于无法获得氘代NEP标准品，因此使用了氘代3,4-亚甲基二氧甲基苯丙胺（MDMA-d5）作为内标。标准品在分析前后均储存在-20 ℃环境中。HPLC-MS级别的甲醇（MeOH）、异丙醇（IPA）、乙腈（ACN）和水，以及试剂级别的氯仿、乙酸乙酯和氢氧化铵（25% v/v水溶液）均购自Carl Roth（德国卡尔斯鲁厄）。
开发用于分离NEP及其主要第一相代谢物的对映选择性SFC-MS-MS方法
为了开发NEP及其第一相代谢物的对映选择性方法，首先使用多种流动相对所有手性柱进行了筛选。在测试的固定相中，Lux i-Amylose-3手性柱表现出了最有希望的结果，因此被选为进一步方法优化的对象。
随后，对流动相组成进行了系统优化，以实现所需的对映体分离。
结论
本研究中成功实现对极性NEP代谢物的对映体分离和检测，证明了现代SFC-MS/MS的广泛应用能力。固定相化学的进步以及有机改性剂和流动相添加剂的精心选择，使SFC成为分析合成卡西酮等滥用药物中手性代谢物的强大工具。从法医毒理学的角度来看，该方法能够同时实现保留、分离和检测
CRediT作者贡献声明
Bezhan Chankvetadze：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、数据可视化、方法验证、项目监督、资源管理、方法学设计、研究实施、资金获取、概念构思。
Aluda Tchelidze：数据可视化、方法验证、研究实施、数据分析。
Giorgia Sprega：数据可视化、方法验证、数据分析。
Tivadar Farkas：撰写 – 审稿与编辑、资源管理、研究实施、数据分析。
利益冲突声明
我们确认本手稿的所有作者均无任何财务利益冲突。其中一位通讯作者（Bezhan Chankvetaz教授）目前担任《Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis》的主编。B. Chankvetaz教授未参与本手稿的编辑工作，也未参与编辑流程。
致谢
Bezhan Chankvetaz感谢Marche理工大学卓越生物医学科学与公共卫生系为他作为访问教授在安科纳的停留提供财务支持。他还感谢格鲁吉亚Shota Rustaveli国家科学基金会通过N? FR-22–971号基金对这项基础研究的部分资助。
