《Aging Cell》：FGF21-Mediated Upregulation of SIRT1 Delays Intervertebral Disc Degeneration by Promoting PINK1/Parkin Dependent Mitophagy Through Deacetylation of FOXO3
编辑推荐：
本研究针对椎间盘退变（IDD）中髓核细胞（NPCs）衰老机制不清及缺乏有效干预策略的问题，聚焦成纤维细胞生长因子21（FGF21）展开探索。研究发现FGF21通过上调SIRT1促进FOXO3在K241、K258、K289、K568位点的去乙酰化，激活PINK1/Parkin依赖性线粒体自噬（mitophagy），抑制NPCs衰老。体内外实验证实FGF21可改善大鼠IDD模型椎间盘高度及组织学评分，为IDD治疗提供了靶向FGF21-SIRT1/FOXO3/PINK1/Parkin轴的新策略。
腰痛是全球致残的主要原因之一，而椎间盘退变（IDD）作为引发腰痛的常见脊柱退行性病变，其核心驱动机制是髓核细胞（NPCs）的衰老——这些位于椎间盘中央的细胞一旦衰老，会失去增殖能力，打破细胞外基质（ECM）代谢平衡，还会分泌衰老相关分泌表型（SASP），最终导致椎间盘水分流失、结构破坏。尽管已知线粒体自噬（mitophagy，一种选择性清除受损线粒体的自噬过程）对维持细胞稳态至关重要，且SIRT1（NAD+依赖的去乙酰化酶）能通过去乙酰化调控多种蛋白参与抗衰老，但FGF21（成纤维细胞生长因子21）在IDD中的作用，尤其是它如何串联SIRT1与线粒体自噬的具体机制，始终是未解之谜。正是为了填补这一空白，来自兰州大学等机构的研究团队开展了系统研究，最终发现FGF21可通过激活SIRT1/FOXO3/PINK1/Parkin轴促进线粒体自噬，抑制NPCs衰老，为IDD治疗提供了全新靶点。这项重要成果发表在《Aging Cell》上。
研究采用的关键技术方法包括：收集26例不同Pfirrmann分级的人类NP组织样本（分为轻度退变Ⅱ-Ⅲ级和重度退变Ⅳ-Ⅴ级）；建立大鼠IDD模型（通过尾椎Co7/8节段穿刺诱导）；对TBHP（叔丁基过氧化氢）诱导的NPCs衰老模型进行体外干预；通过转录组测序分析差异基因；利用Co-免疫沉淀（Co-IP）结合质谱鉴定SIRT1相互作用蛋白；采用Western blot、免疫荧光、共聚焦显微镜观察、透射电镜（TEM）、mCherry-EGFP-LC3双荧光腺病毒监测自噬流等技术验证分子机制；并通过体内给药实验评估FGF21的治疗效果。
3.1 FGF21在IDD中下调
通过生物信息学分析GEO数据库单细胞RNA测序数据，筛选出入侵性NPCs衰老相关的16个差异基因，其中FGF21因与细胞衰老密切相关被选中。临床样本分析显示，重度退变人类NP组织中FGF21表达显著低于轻度退变组织，且与P16、P21、P53等衰老标志物呈负相关，还与年龄、症状持续时间、Pfirrmann分级显著相关（p值分别为0.004、0.017、0.008）。大鼠IDD模型及TBHP诱导的NPCs模型中，FGF21同样下调，且伴随NPCs衰老表型（如SA-β-Gal染色阳性率升高、线粒体损伤）。
3.2 FGF21抑制NPCs衰老
体外给予外源性重组大鼠FGF21干预TBHP诱导的NPCs，发现FGF21以剂量依赖性方式降低P16、P21、P53表达，减少SA-β-Gal阳性细胞，同时恢复线粒体膜电位（JC-1染色）和ATP水平，降低细胞内及线粒体活性氧（ROS，分别用DCFH-DA和MitoSOX探针检测），提升超氧化物歧化酶（SOD）活性，减轻脂质过氧化产物丙二醛（MDA）积累，缓解氧化应激损伤。在IL-1β诱导的NPCs退变模型中，FGF21同样发挥抗衰作用。
3.3 FGF21激活线粒体自噬
转录组测序显示FGF21处理组富集于自噬和选择性自噬通路，尤其线粒体自噬。人类重度退变NP组织和大鼠IDD模型中，LC3（微管相关蛋白轻链3）表达降低、P62积累，提示线粒体自噬受抑；而FGF21处理后，LC3-II/I比值升高、P62减少，且促进LC3与线粒体膜蛋白Tom20共定位（免疫荧光），增加mCherry-EGFP-LC3标记的黄色（自噬体）和红色（自噬溶酶体） puncta（双荧光腺病毒），透射电镜观察到更多自噬体结构，证实FGF21促进线粒体自噬流。
3.4 FGF21通过线粒体自噬抑制NPCs衰老
使用线粒体自噬抑制剂Mdivi-1或敲低Drp-1（动力相关蛋白1）后，FGF21的抗衰作用（降低衰老标志物、恢复线粒体功能、减少ROS）被逆转，且线粒体自噬激活效应消失，证明FGF21的抗衰作用依赖线粒体自噬。
3.5 FGF21通过PINK1-Parkin通路激活线粒体自噬
qPCR和Western blot显示FGF21剂量依赖性上调PINK1、Parkin的mRNA及蛋白（包括磷酸化形式p-PINK1、p-Parkin）表达，促进二者向线粒体转位（亚细胞分离实验），增强Parkin与Tom20共定位。敲低PINK1或Parkin后，FGF21诱导的LC3-II增加、P62减少及自噬体/溶酶体形成均被阻断，且在IL-1β模型中结果一致，明确FGF21通过PINK1-Parkin通路激活线粒体自噬。
3.6 FGF21上调SIRT1表达
转录组测序提示SIRT1被FGF21上调。人类重度退变NP组织和大鼠IDD模型中SIRT1表达降低，而TBHP或IL-1β诱导的NPCs中，FGF21以浓度依赖性提升SIRT1蛋白水平，表明SIRT1是FGF21的下游靶标。
3.7 SIRT1过表达激活线粒体自噬
过表达SIRT1可抑制TBHP诱导的NPCs衰老，改善线粒体功能（ATP、膜电位）和氧化应激（ROS、MDA），同时上调PINK1/Parkin通路，促进Parkin线粒体转位及LC3与Tom20共定位，激活线粒体自噬。
3.8 FGF21通过上调SIRT1抑制NPCs衰老
敲低SIRT1后，FGF21对TBHP诱导的衰老标志物（P16、P21、P53）的抑制作用消失，线粒体功能和抗氧化能力提升也被削弱，证实SIRT1是FGF21抗衰作用的必需中介。
3.9 FGF21通过上调SIRT1激活线粒体自噬
敲低SIRT1显著抑制FGF21诱导的PINK1/Parkin表达及线粒体转位，减少自噬体/溶酶体数量（双荧光腺病毒、TEM），降低LC3-Tom20和Parkin-Tom20共定位，证明FGF21通过SIRT1激活线粒体自噬。
3.10 FGF21减轻大鼠IDD
大鼠IDD模型中，腹腔注射FGF21（100μg/kg/天，持续8周）可部分恢复椎间盘高度指数（DHI）和MRI信号强度，改善组织学评分（H&E、Safranin O、甲苯胺蓝染色显示NP结构保留、蛋白聚糖增加），增加NP区SIRT1、LC3、Parkin、Aggrecan表达，减少P16、P21。但联合椎间盘内注射sh-SIRT1 lentivirus后，这些保护作用完全消失，体内验证SIRT1的关键作用。
3.11 FGF21促进FOXO3去乙酰化
转录组富集分析提示SIRT1调控乙酰化。Western blot显示FGF21降低TBHP诱导的全细胞乙酰化水平，且该效应依赖SIRT1（敲低SIRT1后逆转）。Co-IP结合质谱发现SIRT1与FOXO3相互作用（免疫荧光共定位验证），FOXO3乙酰化在TBHP处理后升高，FGF21处理后降低（依赖SIRT1）。序列比对显示大鼠FOXO3的K241、K258、K289、K568位点高度保守，突变实验（4KQ模拟乙酰化，4KR模拟去乙酰化）证实这些是关键乙酰化位点。
3.12 FOXO3去乙酰化是FGF21诱导线粒体自噬的关键
过表达SIRT1或FGF21可促进野生型FOXO3（WT）介导的线粒体自噬（激活PINK1/Parkin、增加自噬体），但对4KQ（乙酰化模拟）无效，却增强4KR（去乙酰化模拟）的线粒体自噬和抗衰作用。敲低SIRT1仅影响WT FOXO3的表型，不影响突变体，证明SIRT1介导的FOXO3去乙酰化是FGF21激活线粒体自噬的必要步骤。
研究结论明确：FGF21通过上调SIRT1，促进FOXO3在K241、K258、K289、K568位点的去乙酰化，进而激活PINK1/Parkin依赖性线粒体自噬，抑制NPCs衰老，最终延缓IDD进展。体内外实验均证实，SIRT1是该通路的必需中介，敲低SIRT1会完全阻断FGF21的保护作用。
讨论部分进一步阐释了研究的价值与局限：首先，本研究首次揭示FGF21在IDD中的作用机制——通过SIRT1/FOXO3/PINK1/Parkin轴激活线粒体自噬，此前虽有研究提示Parkin可能影响FGF21水平，但未明确FGF21对PINK1/Parkin通路的调控，这为IDD机制研究提供了新视角。其次，发现的FOXO3去乙酰化位点为精准干预提供了靶点，解决了“FGF21如何具体调控线粒体自噬”的关键问题。但也存在局限：仅使用雄性SD大鼠，未考虑性别差异；FGF21的系统给药可能通过改善全身代谢间接保护椎间盘，需进一步区分局部与全身效应；药代动力学特征未明确，有待优化给药方案。
总体而言，这项研究不仅阐明了FGF21抗IDD的分子机制，更为开发靶向FGF21-SIRT1/FOXO3/PINK1/Parkin轴的IDD治疗策略提供了坚实的理论基础，有望推动IDD干预从“对症”走向“对因”，为无数腰痛患者带来新希望。
