过氧化物酶模拟碳点通过竞争性清除羟基自由基，实现了白藜芦醇的双模式检测

《Microchemical Journal》：Peroxidase-mimetic carbon dots enable dual-mode resveratrol detection via competitive hydroxyl radical scavenging

基于Fe掺杂碳点的双模式传感平台通过羟基自由基清除实现白藜芦醇的高灵敏检测，兼具自验证的荧光与吸光度信号，适用于葡萄酒及葡萄皮提取物的快速分析，无需复杂预处理。

　　

Mohamed N. Goda|Laila S. Alqarni|Faisal K. Algethami|Hossieny Ibrahim|Mohamed M. El-Wekil|Ramadan Ali|Suliman A. Almahmoud|Al-Montaser Bellah H. Ali

沙特阿拉伯利雅得11623，伊玛目穆罕默德·伊本·沙特伊斯兰大学（IMSIU）科学学院化学系

摘要

本研究开发了一种基于掺铁碳点的双模式传感平台，该碳点具有类似过氧化物酶的活性。这些碳点通过类似芬顿的反应机制催化H?O?分解，生成羟基自由基（•OH）。这些•OH自由基将3,3′,5,5′-四甲基联苯胺（TMB）氧化为蓝色氧化TMB（oxTMB），在652纳米处产生比色信号，同时使碳点自身失活。白藜芦醇的酚羟基基团在TMB被氧化之前优先捕获•OH自由基，从而抑制了oxTMB的形成，产生了相反的双重信号：比色信号减弱（吸光度降低）和荧光信号恢复（荧光增强）。荧光模式的线性范围为0–50.0 ng/mL，检出限为1.78 ng/mL；比色模式的线性范围为10.0–60.0 ng/mL，检出限为2.95 ng/mL。该平台对结构相似的多酚和常见葡萄酒成分具有高选择性，并表现出优异的稳定性。应用于葡萄酒样品和葡萄皮提取物时，回收率分别为97.2%–100.6%（荧光法）和97.1%–102.6%（比色法），相对标准偏差为2.53%–4.08%。这种分析方法仅需5分钟，样品制备简单，且具有双重自验证功能，为葡萄种植和葡萄酒酿造中的常规白藜芦醇质量控制提供了一种实用且经济高效的替代方案。这项工作满足了葡萄种植和葡萄酒行业对快速质量评估的需求，能够实时监测葡萄品种在生长、收获、发酵和陈酿过程中的白藜芦醇含量，并为品种选择、小型生产商以及高端葡萄酒和葡萄提取物市场的真实性验证提供了便捷的分析工具。

引言

白藜芦醇（3,5,4′-三羟基芪）是一种多酚类植物抗毒素，由葡萄藤在受到真菌感染、紫外线辐射和环境压力时产生，主要积累在葡萄皮中，是红葡萄酒中的关键生物活性化合物[1]。随着流行病学观察发现适量饮用红葡萄酒与心血管疾病发病率降低之间的关联（“法国悖论”），白藜芦醇因其心脏保护、抗炎、神经保护和延长寿命的作用而受到广泛关注，其作用机制包括激活sirtuin蛋白、抗氧化活性以及调节细胞信号通路[2]。不同葡萄品种、葡萄种植方式和酿酒工艺中的白藜芦醇含量差异显著（葡萄皮中含量为0.2–5.8 mg/g），红葡萄酒中的白藜芦醇含量通常为0.1–15 mg/L，而白葡萄酒中的含量低于0.5 mg/L，这主要是由于发酵过程中葡萄皮与酒精的接触时间较长[3]。准确的白藜芦醇定量对于多个利益相关者至关重要：酿酒师可通过品种选择和工艺参数优化白藜芦醇含量；监管机构需要验证功能性葡萄酒和营养补充剂的标签声明；研究人员需研究剂量-反应关系；消费者则可根据其健康益处做出购买决策[4]。 以往的白藜芦醇检测方法受到其低天然浓度以及共存成分（如多酚、色素/花青素、单宁、糖类和有机酸）的强烈基质效应的限制，这些成分可能抑制或干扰信号，降低选择性，常常需要复杂的样品预处理步骤（如SPE、LLE、SPME、SBSE、DLLME）[5]–[9]，从而增加了分析时间、溶剂/试剂消耗和操作者间的差异性，并可能在处理过程中造成损失。气相色谱法由于白藜芦醇的挥发性低而需要衍生化处理，增加了额外的步骤和潜在风险[8]、[10]。毛细管电泳法虽然速度快、耗样量少，但灵敏度和迁移时间重复性较差[11]、[12]。即使使用高效液相色谱（HPLC）和传统的紫外/二极管阵列检测器（UV/DAD），在复杂基质中也可能选择性不足/灵敏度不够，除非配合严格的样品预处理或高端检测器[13]，而且某些方法仅检测反式白藜芦醇，可能低估了总芪类化合物的含量。因此，亟需更环保、更简单、更灵敏/选择性的分析平台。 碳点（CDs）作为一种多功能荧光纳米材料，在传感应用中相比传统量子点和有机染料具有明显优势。这些准球形纳米粒子（2–10 nm）具有基于量子限制效应、含氧官能团（羧基、羟基、羰基）以及碳核内的sp2共轭结构的激发依赖性光致发光特性[14]、[15]、[16]。它们可通过水热碳化、微波热解或富含碳的前体（柠檬酸、葡萄糖、生物质）的化学氧化等方法合成，无需复杂设备或有毒试剂，便于大规模生产[17]。碳点还具有出色的光稳定性、低细胞毒性以及丰富的表面化学性质，适合进行光学生物传感[18]。其荧光可通过多种机制调节，例如分析物结合时的直接淬灭、F?rster共振能量转移（FRET）、光诱导电子转移（PET）和内部滤光效应（IFE），适用于从金属离子和生物分子到活性氧物种和药物化合物等多种分析物[19]。 最新研究发现，某些碳点具有类似过氧化物酶的活性，可通过表面缺陷、杂原子掺杂（氮、硫）或前体中的残留金属离子介导的类似芬顿的反应机制催化过氧化氢分解，生成高活性的羟基自由基（•OH）[20]、[21]。这种催化性质使碳点能够氧化显色底物（如3,3′,5,5′-四甲基联苯胺（TMB），TMB在•OH的作用下发生单电子氧化，形成蓝色氧化TMB（oxTMB，λmax约为652 nm），具有强烈的可见光吸收[22]。氧化产物同时具有双重分析功能：提供直接的比色信号（吸光度增加）和淬灭碳点荧光（由于oxTMB的宽吸收光谱500–700 nm与碳点的发射波长重叠）。这种双模式检测平台通过单一酶促反应产生正交的比色（吸光度增加）和荧光（荧光减弱）信号，实现了内置的交叉验证、扩展的动态范围，并通过信号一致性要求减少了假阳性结果。应用实例包括葡萄糖检测（通过葡萄糖氧化酶生成的H?O?）[22]、抗氧化能力筛选[21]和酶活性测定，表明类似过氧化物酶的碳点是天然辣根过氧化物酶（HRP）的实用替代品，具有更优的稳定性、更低的成本和更简单的制备过程。 本研究基于白藜芦醇的酚羟基基团的捕获能力，提出了一种用于葡萄酒和葡萄提取物中白藜芦醇定量检测的双模式传感平台[23]。该检测方法利用类似过氧化物酶的碳点催化H?O?分解为•OH自由基，这些自由基将TMB氧化为蓝色oxTMB，同时产生比色信号（652 nm处的吸光度增加）和淬灭碳点荧光。当加入白藜芦醇后，其酚羟基基团（3,5,4′-三羟基芪）以剂量依赖的方式捕获•OH自由基，优先与TMB反应，抑制oxTMB的形成。这种羟基自由基的捕获产生了相反的双重信号：（1）比色模式下吸光度降低，表明形成的oxTMB减少；（2）荧光模式下荧光恢复，表明oxTMB减少导致的光学衰减减弱。这种统一的机制——白藜芦醇捕获碳点生成的•OH自由基——通过一致的双重输出实现了自我验证的定量，同时无需色谱分离。简单的样品制备（葡萄酒稀释或葡萄皮提取）结合快速测量，使该方法成为葡萄种植和葡萄酒酿造中常规白藜芦醇质量控制的实用工具，性能可与高效液相色谱相媲美，且无需昂贵的基础设施。

与现有的白藜芦醇检测方法相比，本研究提出的方法在灵敏度、简便性和分析可靠性之间取得了良好的平衡。基于纳米酶催化的TMB氧化的比色检测方法操作简单且经济高效，但它们依赖于单一的吸光度响应，在复杂基质中可能降低准确性[24]、[25]。相比之下，荧光检测方法通常具有更高的灵敏度，但仅依赖一个分析信号[26]、[27]。本研究通过将比色和荧光检测整合到一个由白藜芦醇的相同羟基自由基捕获机制控制的单一检测中，克服了这些限制。因此，oxTMB吸光度的降低和碳点荧光的恢复作为分析物浓度的双重、一致指示器，增强了方法的可靠性。此外，该方法快速、无需色谱分离，适用于葡萄酒和葡萄提取物等实际样品。这些特点突显了所提出方法相对于以往单模式荧光或比色方法的实用性。

材料和试剂

白藜芦醇、葡萄素、阿魏酸、氯化钠、槲皮素和柠檬酸可从德国Merck（Sigma-Aldrich/MilliporeSigma）购买；芸香苷、乙醇、三氯化铁（Fe(III)）、咖啡酸和氯化镁可从美国Thermo Fisher Scientific购买；没食子素、山梨酸、硫酸铜(II)、葡萄糖和香草醛可从美国Avantor（VWR）购买；而山柰酚、绿原酸、抗坏血酸和硫酸亚铁

碳点的表征

通过多种分析技术对碳点进行了全面表征。透射电子显微镜（TEM）显示碳点分布均匀，呈准球形纳米颗粒。粒径分析显示粒径范围狭窄，介于3至8 nm之间，平均直径为5.6 nm，表明成功合成了量子限制的碳纳米结构（见图S1）。这种小的粒径对于观察到的量子效应至关重要

结论

本研究开发了一种基于掺铁碳点的新型双模式白藜芦醇检测平台，这些碳点具有类似过氧化物酶的活性。该方法利用白藜芦醇对羟基自由基的竞争性捕获机制，同时调节比色和荧光信号，实现了无需色谱分离的自我验证定量。机制研究表明，Fe3?位点催化类似芬顿的反应，生成•OH自由基

CRediT作者贡献声明

Mohamed N. Goda：研究、资金获取、数据分析、概念化。 Laila S. Alqarni：软件开发、资源管理、方法设计、研究。 Faisal K. Algethami：数据可视化、验证、资源管理、研究、数据分析、概念化。 Hossieny Ibrahim：验证、监督、软件开发、数据管理、概念化。 Mohamed M. El-Wekil：初稿撰写、数据可视化、概念化。 Ramadan Ali：初稿撰写

资助

本研究得到了伊玛目穆罕默德·伊本·沙特伊斯兰大学（IMSIU）科研处的支持和资助（资助编号：IMSIU-DDRSP2601）

利益冲突声明

作者声明没有已知的利益冲突或个人关系可能影响本文的研究结果。