《Microchemical Journal》：Rapid portable detection of chemical warfare agent mimic diethyl chlorophosphate (DCP) using a rhodamine-quinoline conjugated probe with fluorescent “turn-on” and chromogenic responses, and cancer cell imaging
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敌敌畏检测化学传感器RDE的合成与应用研究，通过缩合反应制备新型荧光探针，实现5秒内颜色由浅黄变粉红及紫外荧光增强27倍的双模式响应，结合便携试纸和智能手机分析平台，验证了其在环境与生物样本中的实用价值。
Karuppaiyan Kaviya|K. Nikhil Kanna|Werner Kaminsky|S. Prince Makarios Paul|Tsai-Xuan Lin|Shu-Pao Wu|Ramar Rajamanikandan|Kailasam Saravana Mani
印度泰米尔纳德邦哥印拜陀卡帕加姆高等教育学院化学系
摘要
高毒性神经毒剂的量化至关重要，因为它们对健康具有严重风险，并可能导致灾难性后果，这突显了快速、可靠和现场检测平台的必要性。在这项研究中，我们介绍了一种便携式的高性能传感器，专门用于检测二乙基氯磷酸酯（DCP），该传感器具有超快响应、操作简便以及在现场应用中的强大适应性。为了检测DCP，我们通过罗丹明肼和6,8-二甲基-2-氧代-1,2-二氢喹啉-3-醛之间的简单缩合反应，开发出了(Z)-2-(((6,8-二甲基-2-氧代-1,2-二氢喹啉-3-基)亚甲基)氨基)-3′,6′-双(乙氨基)-2′,7′-二甲基螺[异吲哚-1,9′-呫吨]-3-酮（RDE）。所得到的RDE分子通过分析光谱技术和单晶X射线衍射分析得到了成功表征。当DCP注入RDE溶液中时，598纳米处的荧光信号增加了约27倍，表明其具有强烈的荧光“开启”响应。DCP与RDE之间的相互作用引起了可观察到的显色变化：在日光下从淡黄色变为粉红色，在紫外光照射下从无色变为黄色荧光。RDE探针中的罗丹明核心作为反应识别单元，能够快速与DCP相互作用，并在5秒内产生荧光信号，体现了传感器的超快响应动力学。我们采用了基于试纸的测试套件和智能手机辅助的RGB比色分析等便携式平台，来评估所开发的RDE传感器在快速现场检测DCP方面的实际应用能力。这些便携式方法实现了DCP的视觉识别和半定量分析，显著降低了仪器成本，加快了响应时间，并简化了操作程序，从而证明了该传感器的现场部署实用性和实际应用价值。此外，开发的RDE受体还用于癌细胞成像中的DCP检测。
引言
神经毒剂是一类极其致命的有机磷毒素，由于它们能迅速渗透并产生不可逆的生化作用，可在几分钟内导致死亡[1]。由于在军事和非对称冲突中的战略重要性，这些化合物（尤其是G系列有机磷化合物）被归类为化学战剂（CWAs），它们具有高挥发性、高效的环境扩散性和极强的神经毒性[2]、[3]、[4]、[5]。尽管这些化合物首次合成于第一次世界大战期间的德国[6]，但它们在1995年东京地铁袭击和2017年汗谢赫恩袭击等事件中的持续滥用突显了它们持续的全球威胁[7]。从机制上讲，这些毒剂通过共价磷酸化并抑制乙酰胆碱酯酶来发挥毒性作用，导致乙酰胆碱在突触处积聚，引起持续的胆碱能过度刺激、神经肌肉麻痹，最终导致呼吸衰竭[8]。值得注意的是，G系列神经毒剂如塔崩（GA）、沙林（GB）和梭曼（GD）及其结构相关的类似物（见图S1）具有高度反应性的磷酸化中心以及优异的离去基团，这些特性显著增强了它们的毒性，并强调了先进检测、去污和实时监测策略的迫切需求[9]、[10]、[11]、[12]、[13]。
在突触处抑制乙酰胆碱的分解会导致严重的神经生理紊乱，从而导致中枢神经系统麻痹、多器官衰竭，在急性暴露的情况下，人类和动物几乎会立即死亡。这些外源性毒剂通过吸入、皮肤吸收以及通过受污染的水源、食物或环境储存库进入生物系统[14]、[15]。由于有机磷毒素的高亲电性、强烈的毒效作用、易于合成以及偶尔的自然存在，它们被反复用作恐怖主义和大规模破坏性行动中的武器[14]、[15]。除了对人类的急性毒性外，合成有机磷杀虫剂和农药在农业中的广泛使用还导致了土壤、地下水和海洋生态系统的持续污染。即使是微量（ppm）的慢性或急性暴露，通过饮用水、农产品或生物累积的海洋生物也可能引起严重的神经毒性综合征，包括胆碱能危机、神经肌肉麻痹、系统器官衰竭和突然死亡[16]、[17]。G系列神经毒剂的高亲电性磷酸基团容易与亲核试剂反应，其中含有杂原子的芳香结构向磷原子捐赠孤对电子，从而实现毒素的选择性分子识别[18]。这种机制推动了各种化学传感器的设计，这些传感器通过亚胺桥连接，能够高度敏感地检测这些危险的神经毒剂[19]、[20]、[21]、[22]。因此，开发快速、灵敏、选择性和可视解释的检测方法对于保护公共健康和加强国家安全至关重要。
为了应对这些毒理学和环境挑战，许多检测平台，包括干涉仪传感器、光子晶体结构、分子内环化和亲核取代反应、基于镧系元素的发光探针、纳米材料辅助信号、酶促生物测定[23]、[24]、光纤传感器阵列[25]、声波传感器[26]、[27]、[28]、电化学生物传感器、离子迁移谱（IMS）、气相色谱和高效液相色谱（HPLC），在准确识别这些神经毒素方面显示出巨大潜力[29]、[30]、[31]、[32]、[33]。然而，由于这些毒剂本身无味、无色且无气味，它们的物理和化学性质难以察觉，因此在没有先进的高分辨率分析设备的情况下很难检测到。
鉴于这些技术限制，荧光传感平台作为一种优越、简单且易于使用的分析策略脱颖而出，用于神经毒剂的监测。它们的优势在于所需的基础设施最少、对有机磷亲电剂的超痕量敏感性、出色的化学选择性、操作简便性、高空间-时间分辨率、便携性以及直接的可视解释性[34]。在这些系统中，经过战略性设计的荧光团与神经毒剂的亲电性磷酸基团发生特定的共价或超分子相互作用，导致荧光强度、寿命、量子产率或发射波长的明确变化。即使在生物相关的巨分子拥挤条件下，这些过程也能保持稳定。由于对真实神经毒剂的严格生物安全限制和国际法规，实验室评估通常使用二乙基氯磷酸酯（DCP）和二乙基氰磷酸酯（DCNP）等结构类似物来探测传感效率和机制的准确性[35]。在本研究中，虽然GB是主要分析对象，但由于DCP的无毒性，它被用作化学上的合理替代品，因为它保留了关键的物理化学特性，包括亲电性、空间特性和反应动力学，与GB非常相似，从而实现了准确和安全的实验近似[36]。
在有机磷（OP）神经毒剂的分子水平上，亲电性磷酸基团通常与化学传感框架中整合的各种亲核官能团发生共价或配位相互作用，包括芳香族和脂肪族羟基残基、吡啶杂环、肟基团、一级和二级胺、螺苯并吡喃荧光团以及基于羰基的电子给体基团。这些相互作用构成了许多OP响应探针中荧光调制的基本信号转导机制。尽管已有几项研究成功地使用离散的荧光系统实现了DCP的独家检测，但此类分子传感模式的进步仍然是一个动态且具有战略重要性的研究前沿[37]、[38]、[39]、[40]、[41]。此外，有机磷作为除草剂和杀虫剂在农业中的持续使用与严重的毒理学后果有关，包括心血管病理生理学改变、肺功能受损、致癌转化和血管稳态紊乱。因此，能够选择性地结合、激活或在与OP-化学战剂（OP-CWAs）相互作用时发生化学转化的化合物或混合材料的合理分子工程对于精确识别和早期危害缓解至关重要[42]、[43]。
总体而言，这些分子和实际考虑强调了迫切需要一种结构简单但响应灵敏的探针，能够高保真地检测DCP蒸气。早期报道的DCP传感荧光团依赖于成熟的基于反应的机制。常见的策略包括在DCP的亲电性磷中心进行亲核取代、磷酸化引发的环开环以及通过化学反应引发的电子重排改变分子内电荷转移（ICT）路径[44]。这些过程自然地将低发射或被抑制的探针转化为强荧光物质，实现荧光“开启”传感。尽管取得了这些进展，但目前许多探针仍具有复杂的分子结构、延迟的反应动力学或低灵敏度[44]。在这种情况下，我们展示了一种罗丹明-喹啉共轭化学传感器（RDE），旨在检测一种简化而有效的磷酸化引发的电子调节路径，以实现DCP的灵敏和特异性测定。当DCP注入RDE时，RDE的弱荧光行为显著增强，同时比色性质从淡黄色变为粉红色。通过NMR、质谱和计算分析研究了这种传感机制。重要的是，我们实现了一个智能手机辅助的平台，用于现场定量评估DCP，能够捕获RDE-DCP负载滤纸的图像，并通过Color Grab软件进行后续的数字比色分析[45]。此外，这种RDE受体还被应用于生物介质（如HepG2细胞）中的DCP检测。这种方法实现了快速（不到5秒）、便携和用户友好的检测，将探针的实验室性能转化为实际用于环境和安全应用的工具。
RDE的合成
探针RDE是通过6,8-二甲基-2-氧代-1,2-二氢喹啉-3-醛（0.2克，1毫摩尔）和罗丹明6G肼（0.42克，1毫摩尔）在10毫升乙醇中的缩合反应合成的。反应混合物在90°C的油浴中回流以促进完全反应。使用薄层色谱（TLC）系统地监测反应进度。反应完成后，通过真空过滤分离出沉淀物。
化学
荧光受体RDE是通过6,8-二甲基-2-氧代-1,2-二氢喹啉-3-醛和罗丹明6G肼在90°C的乙醇中的经典Schiff碱缩合反应合成的，如图1所示。所得到的肼连接受体RDE的分子结构通过一系列光谱和分析技术进行了全面验证，包括FT-IR、1H和13C核磁共振光谱、单晶X射线衍射（XRD）等。
结论
总之，我们成功设计了一种基于罗丹明的喹啉共轭化学传感器RDE，它对神经毒剂模拟物DCP显示出双模式比色和荧光响应。当DCP与受体RDE相互作用时，颜色从淡黄色变为深粉色，而在紫外灯照射下荧光颜色从无色变为黄色，这表明了该传感方法的简单性。
CRediT作者贡献声明
Karuppaiyan Kaviya：撰写——原始草稿、方法学、研究、正式分析、数据管理。K. Nikhil Kanna：方法学、研究、正式分析、数据管理。Werner Kaminsky：方法学、研究、正式分析、数据管理。S. Prince Makarios Paul：撰写——原始草稿、软件、方法学、正式分析、数据管理。Tsai-Xuan Lin：撰写——原始草稿、方法学、研究、正式分析、数据管理。Shu-Pao Wu：撰写——审阅
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文报告工作的财务利益或个人关系。
致谢
这项研究工作得到了科学和技术部（DST/TDT/TC/RARE/2022/13，日期2023年3月27日）的财政支持。作者还感谢哥印拜陀的Karunya技术科学研究所提供的NMR设施。
