《Microchemical Journal》：Targeted
Escherichia coli electrochemical sensing and killing using aptamer-conjugated gold nanostars: a dual-functional nanoplatform
编辑推荐：
大肠杆菌检测、金纳米星、aptamer修饰、光热疗法、机械杀菌
普里扬卡·加格（Priyanka Garg）|尼凯特·拉纳（Niket Rana）|尼特什·普里亚达尔希（Nitesh Priyadarshi）|尼基塔·萨拉瓦吉（Nikita Sarawagi）|尼廷·库马尔·辛格哈尔（Nitin Kumar Singhal）
国家农业食品与生物制造研究所（National Agri-Food and Biomanufacturing Institute, NABI），印度旁遮普邦S.A.S. Nagar第81区，邮编140306
摘要
大肠杆菌已成为全球范围内的一个主要公共卫生问题。因此，对食品中的细菌进行早期和准确的检测至关重要。传统方法非常可靠，但它们受到检测周期长以及需要技术专家的限制。为了克服这些限制，人们广泛研究了纳米材料增强的电化学传感探针。工程纳米材料与适配体（aptamers）和碳水化合物等生物分子结合，用于开发能够靶向特定细菌的生物传感器探针。本研究重点介绍了用于检测大肠杆菌的电化学活性适配体偶联金纳米星（electrochemically active aptamer-conjugated gold nanostars）的合成方法。检测结果显示其具有宽线性范围，检测限为0.1170 CFU/mL。所提出的传感探针在纯培养物和实际样品中对大肠杆菌表现出优异的特异性。此外，还探讨了该纳米探针的靶向杀灭特性，其机械杀菌作用导致高达76%的大肠杆菌被非特异性结合并杀死。有趣的是，当适配体与金纳米星结合后，光热转换效率得到了提高。这种增强作用使得激光诱导的纳米探针样品中的大肠杆菌存活率降低了95%。总之，所开发的双功能纳米平台可能是一种有前景的方法，可用于大肠杆菌的特异性检测和光热清除。
引言
近年来，关于各种临床、食品和环境环境中微生物污染的报道大幅增加[1]。在其他致病细菌中，大肠杆菌（Escherichia coli）被认为是最具传染性的细菌之一[2]。这种致病性大肠杆菌会感染肠道并引起严重腹泻，从而威胁人类生命[3]。腹泻是幼儿尤其是发展中国家儿童发病和死亡的主要原因。频繁发生的疫情凸显了有效干预措施的迫切需求，以避免大肠杆菌引起的感染。早期和特异性地检测大肠杆菌可以防止污染的进一步扩散。目前主要使用的方法包括基于培养的技术[4]、[5]、酶联免疫吸附测定（ELISA）[6]和聚合酶链反应（PCR）[7]，但这些方法非常繁琐且耗时。许多研究表明，生物传感器（特别是电化学传感器）能够在几分钟或几小时内检测到低浓度的大肠杆菌[8]、[9]、[10]。将纳米技术与电化学传感器结合使用，可以进一步提高灵敏度和特异性，并可用于实时监测[11]。此外，纳米材料增强的电化学技术可以轻松构建微型便携式传感器[12]。由于金纳米粒子（AuNPs）具有高催化性、电化学活性和信号放大特性，因此被广泛用于电化学传感器[13]。此外，通过改变AuNPs的大小和形状，还可以提高其导电性[14]。星形金纳米粒子（AuNsts）已被用于检测多种目标，如肿瘤DNA[15]、过氧化氢[16]和六价铬[17]。为了开发特定的电化学传感器，人们广泛使用了对目标分析物具有选择性的适配体[14]、[18]。适配体是短的单链寡核苷酸，能够特异性结合其目标分析物，并提供更高的灵敏度[19]、[20]。一些工程纳米材料同时具备传感和杀菌特性，可以特异性检测并限制细菌的传播[21]、[22]。AuNsts因其尖锐的尖刺而能够造成物理损伤，但不同类型的细菌（革兰氏阴性菌或革兰氏阳性菌）受损程度不同[23]。此外，一些纳米材料本身具有光热特性[24]，或者经过光热剂的功能化处理后能够有效杀灭细菌[25]。光热疗法（PTT）是一种机制，其中光热剂在激光照射下吸收光能并将其转化为热能，从而在细菌周围产生高温，破坏细菌膜并使蛋白质变性，随后产生活性氧（ROS）[26]。研究表明，AuNsts具有优异的光热性能[35]和出色的电化学活性[27]。多项研究探讨了用于检测大肠杆菌的适配体功能化金纳米星。然而，目前的检测机制主要基于比色法和荧光法，其灵敏度低于电化学检测系统。尽管有许多研究文章提出了用于大肠杆菌靶向检测和杀灭的双功能纳米材料，但这些材料相当复杂，需要多步骤处理，从而增加了纳米材料合成的成本。此外，传感研究仅限于目标细菌或分析物的检测。在处理受细菌污染的样品时，谨慎处理这些样品往往被忽视，但这是一个重要的步骤。为了克服这些限制，本研究旨在开发一种高灵敏度、简单易合成的纳米探针，以实现大肠杆菌的靶向检测和光热清除。
在此，我们首先合成了PEG（聚乙二醇）稳定的AuNsts，然后将其与大肠杆菌特异性适配体偶联。整个研究均使用了预先选定的大肠杆菌特异性适配体。通过吸收光谱、Zeta电位、凝胶阻滞和显微镜观察等多种技术对样品进行了表征。随后，将制备好的纳米探针滴涂在丝网印刷的金电极（SPGEs）上，以制造电活性表面。之后，通过循环伏安法（CV）和差分脉冲伏安法（DPV）测试这些电极对大肠杆菌的检测能力。通过对纯培养物和不同添加样品中的大肠杆菌进行DPV伏安图分析，证明了所提出的电化学传感器的出色检测限（LOD）。AuNsts通过机械和光热两种机制杀灭细菌的能力得到了充分研究。令人惊讶的是，AuNsts的机械杀菌作用并未受到适配体结合的影响。因此，在扩散平板实验和显微镜观察中，大肠杆菌和其他细菌受到的影响是相同的。通过用808 nm激光光照射纳米探针，还探讨了AuNsts的光热特性。适配体偶联后，光热转换效率得到提高，这表明AuNsts-Apt可作为光热活性的特异性纳米探针，用于大肠杆菌的靶向清除及其检测（见示意图和支持信息）。
材料与方法
手稿中的所有材料及详细方法均见支持信息（Supporting Information, SI）。
纳米探针的合成与表征
纳米粒子和金纳米星（图1A）是按照既定协议[23]、[29]首次合成的。使用紫外-可见光谱仪、动态光散射仪（DLS）、透射电子显微镜（TEM）和场发射扫描电子显微镜（FE-SEM）对其进行了表征。紫外-可见光谱显示成功合成了AuNPs（图S1A）和AuNsts（图1B），其最大吸收波长分别位于约520 nm和约850 nm。合成的AuNPs进一步用聚乙二醇（SH-PEG-COOH）进行了修饰，该稳定剂也用于AuNsts的制备。
结论
总之，本研究提出了一种双功能纳米探针，它具有适配体特异性、表面形态增强的电化学传感能力、金纳米星的机械杀菌作用以及PTT诱导的ROS产生等优点。合成的AuNsts-Apt纳米探针性质均匀，比AuNPs-Apt具有更大的电活性表面积。这种差异是由于金纳米星基纳米探针的粗糙度和边缘位点增加所致。
作者贡献声明
普里扬卡·加格（Priyanka Garg）：撰写初稿、方法论设计、数据分析、概念构思。尼凯特·拉纳（Niket Rana）：方法论设计、数据分析、概念构思。尼特什·普里亚达尔希（Nitesh Priyadarshi）：验证、方法论设计、概念构思。尼基塔·萨拉瓦吉（Nikita Sarawagi）：验证、方法论设计。尼廷·库马尔·辛格哈尔（Nitin Kumar Singhal）：撰写与编辑、撰写初稿、监督、资源管理、项目协调、资金获取、概念构思。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的财务利益或个人关系。
致谢
我们感谢生物技术系（核心资助）和CSIR应急资助（文件编号：09/1080(0023)/2021-EMR-I）提供的资金支持。同时，我们也感谢国家农业食品生物技术研究所的支持。
