综述：基于g-C、3N和4的光电化学传感平台：从材料工程到智能监测

《Microchemical Journal》：g-C 3N 4-Based photoelectrochemical sensing platforms: from material engineering to intelligent monitoring

针对混合生物痕迹检测效率低的问题，本研究开发了一种新型侧流生物传感系统，通过整合多聚酶链式反应与金纳米粒子免疫层析技术，实现静脉血、精液、唾液和月经血四类体液同步快速检测，总耗时约3.5-4小时，视觉读数可在15分钟内完成，并成功检测了新旧混合样本。

　　

Jinding Liu|Gengqian Zhang|Hailing Yang|Jiayan Li|Jiaxin Ji|Wenrui Tian|Yuxin Zhang

山西医科大学，中国

摘要

快速可视化多重检测各种人体液体对于迅速解决刑事案件具有重要意义。由于大多数市售的快速检测方法都是基于抗原-抗体结合来检测单一目标的，因此它们在处理混合生物污渍证据时效率较低。因此，开发一种检测常见人体液体的方法对法医学界至关重要，尤其是在犯罪现场留下的证据有限的情况下。本研究提出了一种新型侧向流动生物传感器系统，该系统结合了多重聚合酶链反应（PCR）和基于金纳米粒子的免疫层析技术，通过靶向四种高表达的特异性mRNA生物标志物，实现对四种人体液体（静脉血、精液、唾液和月经血）的同时可视化识别。该检测方法使用带有寡核苷酸序列标记的引物和6-FAM荧光染料进行多重PCR。扩增产物通过条形码与预先固定在膜上的互补序列之间的杂交被捕获，并通过金纳米粒子/抗FAM抗体复合物进行可视化检测。包括RNA提取、逆转录、PCR和条形码检测在内的整个检测过程大约需要3.5-4小时，可视化结果可在15分钟内获得。该方法在人体液体检测方面表现出高特异性。对于未知样本，所有四种人体液体在20倍cDNA稀释度下都能被清晰检测到，其中精液、月经血和静脉血的检测限（LOD）达到40倍。该方法成功检测了新鲜样本以及室温下存放超过6个月的两种老化样本中的目标液体。此外，该系统在模拟的混合人体液体样本中也表现良好，表明其具有分析老化和混合样本的潜力。总体而言，该系统在个体识别之前确定组织来源方面具有巨大潜力，可以作为检测各种人体液体的核心平台。

引言

人体液体的识别是法医证据分析中的关键任务。人体液体含有丰富的遗传信息，可以为确定个体身份、组织来源、沉积时间、老化程度以及捐赠者的生理特征等方面提供直接和必要的数据[1]、[2]、[3]、[4]。这些信息对于揭露犯罪者的身份和重建犯罪现场发生的情况至关重要[5]。因此，准确识别个体体液对于有效的刑事调查是不可或缺的[1]。

法医工作者已经开发了许多方法来识别生物污渍中的人体液体来源。这些方法可分为现场方法和实验室依赖方法。现场方法如商业化的免疫层析试纸（针对人类血红蛋白（RSID?-Blood）和精液（针对前列腺特异性抗原（PSA）（RSID?-Semen））可以在几分钟内确定人体血液和精液的类型，无需特殊设备和操作，并具有高灵敏度[6]、[7]。而实验室依赖方法虽然耗时较长，但使用一组特异性体液标志物（mRNA、miRNA、DNA甲基化标志物甚至微生物组标志物）在毛细管电泳（CE）或大规模并行测序（MPS）平台上进行可视化或分析[1]、[5]、[8]、[9]。然而，这些单一目标的试纸无法满足多种法医样本的需求。例如，从强奸案中获得的精液/月经血混合物包含两种组织成分，PSA阳性结果可以提供帮助，但无法确定混合物的具体成分。对于其他体液（包括唾液和月经血），目前还没有成熟的基于特异性抗原的试纸。

在这项研究中，我们选择了mRNA标志物，因为它们已经被许多学者充分研究和验证。作为基因表达的中间产物，mRNA直接参与了蛋白质合成，反映了细胞的实时功能状态。此外，每个细胞中mRNA的高拷贝数使其具有更强的抗降解能力，从而延长了成功检测的时间窗口。CE和MPS是用于此目的的主要实验室高分辨率分析技术。这些方法可以直接以高特异性和准确性检测精液、月经血、唾液和静脉血的mRNA标志物，使得基于mRNA的检测成为一种关键方法。Song等人开发了一种新型的多重mRNA分析系统，包含19个标志物，通过逆转录终点聚合酶链反应（RT-PCR）来识别五种类型的人体液体[10]。Liu等人开发了一种MPS检测方法，包括来自45个体液/组织特异性基因的202个编码区SNP（cSNP），以识别六种体液/组织的来源及其相应的捐赠者[11]。Neis等人描述了在IonTorrent S5平台上开发的广泛mRNA/cSNP面板，包含30个mRNA标志物和70个cSNP[12]。Haas等人结合了17个EUROFORGEN和EDNAP实验室，建立了两个MPS面板来识别六种体液/组织[13]。然而，尽管这些方法具有高特异性，但在现场常规检测中存在显著局限性：它们耗时较长（最短周转时间≥5小时），需要专业人员和设备，并且必须在集中式实验室环境中进行。

在法医工作中，迫切需要快速的现场体液检测来提供即时的调查线索并指导警方决策，特别是对于缺乏特定常规检测方法的唾液和月经血。侧向流动试纸（LFS）技术为满足这一需求提供了有希望的解决方案。许多研究人员专注于通过检测特定寄生虫或微生物特征来识别体液污渍。例如，Beatty等人利用LFS特异性检测了Trypanosoma cruzi和法医粪便样本中的人类血液[14]。Yu等人将聚合酶链反应（PCR）与侧向流动试纸结合，实现了唾液和阴道分泌物的可视化检测[15]。Liang等人结合嵌套PCR和等温扩增技术，使用LFS构建了一个快速检测系统，用于检测可疑阴道液体中的特定微生物[16]。同时，利用RNA的特异性和高拷贝数，研究人员还探索了使用组织特异性mRNA标志物进行体液识别。Su等人开发了一种新的应用，结合CRISPR-Cas技术和侧向流动试纸（LFS），使用ALAS2位点标志物实现了血液的敏感和特异性检测[17]。在我们之前的研究中，我们通过结合RPA和LFS，针对唾液和阴道分泌物中的mRNA特异性位点，建立了一个快速可视化检测系统。该系统能够在30-42°C下在一个试管内完成扩增和检测，耗时10-25分钟[18]。许多这类LFS方法在优化实验室条件下通常可以在大约2小时内完成体液来源的追踪。然而，目前体液的多重检测仅限于检测两种类型的样本。在法医实践中，静脉血、精液、唾液和月经血是实际案件中最常见的生物证据。因此，开发一种结合mRNA标志物的特异性、快速性和可视化读数的集成方法，以同时检测多种体液至关重要。

在这项研究中，我们开发了一种基于特定mRNA标志物的侧向流动生物传感器，用于识别四种类型的体液。通过在反向引物的5′端标记寡核苷酸序列，我们在单链标记的扩增产物和试纸上预先固定的互补寡核苷酸之间建立了特定的互补配对。这使得无需任何额外设备即可对结果进行可视化解释。独特的单链尾部设计促进了体液的多重扩增系统的建立，使得可以在单个试纸上同时可视化和识别精液、月经血、唾液和静脉血，从而提供了一种快速的现场检测解决方案。

样本收集

所有采样程序均获得了山西医科大学伦理委员会的批准（批准编号2021GLL052）。所有参与者都提供了书面知情同意书。参与者均为健康的年轻人，年龄在20-25岁之间。收集的样本汇总见表1。共有40人提供了样本，包括20名女性和20名男性。静脉血（BL）通过静脉穿刺收集到EDTA-Vacutainer管中。精液（SE）样本

侧向流动生物传感器的优化

成功建立了一种多重侧向流动生物传感器，用于同时可视化检测四种体液，即精液（KLK4）、月经血（PAEP）、唾液（HTN3）和静脉血（HEMGN）（见图S3）。对关键检测参数的系统优化得出了以下最佳条件，这些条件在所有后续实验中均得到应用：（1）胶体金-抗体结合在pH值为4 μL的0.2 M K?CO?条件下进行优化（见图S4a）；（2）最强的

讨论

在法医现场调查中，同时检测多种体液的能力对于加快案件解决速度和保护社会稳定具有重要意义。通过使用LFS技术，我们建立了一个多重扩增系统和多目标共检测平台。这是法医体液分析领域的首次尝试，该方法允许在同一试纸上同时识别四种体液：精液、月经血、唾液和静脉血。

结论

本文建立了一种便携式侧向流动生物传感器，用于在即时护理场景中通过互补寡核苷酸配对实现四种体液的快速可视化检测。该系统对精液、月经血和静脉血的检测灵敏度优于唾液，同时保持了出色的特异性。它能够有效识别1:1比例的混合体液，并且在新鲜样本和储存样本中均表现出可靠的性能

CRediT作者贡献声明

Jinding Liu：撰写——原始草稿、方法学、调查、数据管理。Gengqian Zhang：撰写——审稿与编辑、项目管理、资金获取、概念构思。Hailing Yang：验证、资源协调、方法学、调查。Jiayan Li：资源协调。Jiaxin Ji：资源协调。Wenrui Tian：资源协调、方法学。Yuxin Zhang：资源协调、方法学。

资助

本研究得到了中国自然科学基金（编号82171876）、山西省地方科技发展引导基金（编号YDZJSX2024D061）和山西省基础研究计划（编号202503021211136）的支持。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的财务利益或个人关系。